不好意思， 打扰了~~ 其实我是使用这个KIT组 Ecoli Gene Deletion Kit http://www.genebridges.com/products/quick-easy-e-coli-gene-deletion-kit ※ 引述《lchd (...)》之铭言： : 最近也用过这个方法,做了几个KO strain : 应该可以给你一些建议 : 看起来primer ok, 我觉得不是PCR的问题,而是没有成功的菌落产生 : 且如板友所说genomic DNA萃取可能也有问题, : 不过我认为还是把心力花在提高成功率吧 : 我觉得你可以从几个方向着手修改试试看 : 1.送进去的DNA浓度 : 看你之前的文章,似乎在切胶纯化的时候就已经浓度不高了 : 可以的话尽量让纯化出来的浓度约50-100ng/ul,成功率会较高 因为之前一直无法成功P出所想要的序列， 所以就直接向厂商订做了所需要的取代序列。 在订做前，也有向kit的原厂询问相关序列的设计问题。 原厂表示序列的设计方式没有错误。 每次实验添加1.5 ul 约为350ng的量。 : 2.Kanamycin plate : 有版友提到,可以试着提高一下plate的浓度, : 就我的经验 15ug/ml太低了 之前有提高到大约30ug/ml， 主要是挑菌後筛选的。 : 你也可以把现在挑到的菌用LB+Kanamycin 液体培养一天看看, : 测试是不是真的有抗K 现在做的大多是挑clon後液态培养一晚， 在抽genomic DNA做PCR。 : 3.Control 有做吗？: 没有电DNA的菌,跟实验组等量涂在你的15ug/mL k plate上 : 如果也长很多的话,那就不用继续P下去了 有利用原厂附的比较菌种做测试， 原始菌种也有测试过不带任何抗性。 : 4.查一下colony PCR吧,比较快也可以多筛几颗菌落,不需要抽完genomic DNA才做PCR 小弟大盖已经挑了20颗以上， 想请问clony PCR的温度时间是否要再提高? : 5.几个杂项,arabinose有加吗？,competent cell浓度够吗？电完菌的recover 时间? 确定添加50 μl 10 % L-arabinose 每次电穿孔前有先测量OD600 约为0.5 培养了4小时的时间。 : 加油,祝你好运 最近有更改一下PCR的条件， 第一步， 94度 5分钟。 第二步， 94度， 30秒。 56度， 60秒。 68度， 2分30秒。 第三部， 68度， 7分钟。 然後试了两家不同的polymerase。 这是这次的结果。 http://ppt.cc/utTT 在2~3K位置似乎有些band出现了。 (希望不是错觉。 我想过个好年阿 QAQ...) 最前面那两管是我取原本的未经任何修饰的菌种做PCR的尝试， 请问是否有方法可以提高专一度? 感谢各位大大了 也感谢大家给的建议~~ --

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