脑补 默默的觉得你的vector可能有一个点换错地方了XD chromosome被重组 所以有抗性 但是p不出来 可以多用几组primer交叉测试一下 或是看一下crossover的点有没有办法在genome里面blast到其他东西 然後mycycler好像要升级才能用gradient 问问你们经销商吧 ※ 引述《licat (licat)》之铭言： : ※ 引述《polomi (polomi)》之铭言： : : 去除的片段长度约为450 bp， : : 而使用插入取代的抗性片段约为1.6 KB。 : 那你原本设计用来确认重组状况的primer，离置换位置有段距离 : 会让PCR困难度变高，可以考虑设计得近一点 : (不过看你PCR的图，这应该不是做不出来的主因) : : 利用kanamycin 15ug/ml， : : 互换的机制是同源重组交换的方式。 : : 有一个大陆的网站写得满浅显易懂的， : : http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology : : 主要的参考是这篇paper : : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079 : 我用过这个系统，跟其他互换系统相比没那麽顺利 : 虽然看起来很简单但不容易除错，DNA电进去後都不知道出了啥事 : 如果你能找到用得很顺的人，建议直接跟他请教 : 如果周围没有，而你又是作E. coli，我觉得你换用SacB系统做还比较好 : : 各加上目标取代位置前後各50bp送入。 : : 主要送入方式都是以电穿孔的方式。 : : 　 : : 因主要表现重组蛋白的质体为温度敏感型， : : 过程中都有注意培养的温度是否有低於30度。 : : 那个我有取只含有重组蛋白质体的菌来pcr过， : : 用原本的primer表现， : : 的确原本的片段长度约为1KB左右。 : : 应该可以初步排除杂菌的可能性。 : 以上所述是无法排除的啦 : 但我猜那些菌落还是你的E. coli，而且有发生重组所以才有Km抗性， : 然後你的PCR也才会变成作不出来 : 只是重组方式跟原本预期的不一样... : : 恩我用附图的方式可以吗? : : http://ppt.cc/5iBm : : 请原谅我必须删掉我的目标序列名称。 : : 　　 : : 阿~~~ : : 希望不要阿。 : : 我连发票都是一整年顶多中一张200的机会啊 QAQ : 这跟机率无关，你应该找有经验的人帮你看一下整个互换设计跟引子位置是否正确 : : 　 : : 其实原先主要的annealing温度为58度， : : 现在有尝试过， : : 50 55 58 60 62 64， : : 主要都是30秒。 : : 也有尝试着加入DMSO， : : 其结果如下图: : : http://ppt.cc/C99u : : 感谢您， : : 我会先尝试着降低温度试试看～ : 嗯...多了解後，我觉得改PCR条件的成功机率不高，但还是祝你好运 --

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