作者swoopsky (杨P)
看板Biotech
标题[求救] siRNA transfection问题
时间Sat Feb 21 15:29:53 2015
各位大大好，目前在做siRNA transfection的实验，
的是为了要验证用meta-analysis 找出的基因是可信的。
但最近试了几次不同siRNA的浓度，效果一直不稳定QAQ。
[细胞株]: MCF-7 和 MDA-MB-231
[siRNA]: IDT DsiRNA (27 mer)
[transfection reagent]: lipofectamine (invitrogen)
[实验步骤]: (目前是测试siRNA的浓度哪个较好)
[测试siRNA浓度为 30nM 20nM 10nM]
使用6 well 来进行实验，每一个well最後medium体积为 1.5 ml。
{siRNA}
1. 先由 20uM siRNA (stock)取出後加入serum及antibiotic-free medium
做成 300 nM siRNA 静置5-10分钟後在序列稀释成 200 nM 以及 100 nM siRNA
(因之後再加入MEDIUM会将siRNA浓度稀释10倍变成预测试的30,20,10nM)
{lipofectamine}
2.做出比例为 5ul lipofectamine in 150ul serum及antibiotic-free medium 的stock
(也是有静置5-10分钟)
{siRNA/lipofectamine}
3.在150ul 300nM, 200nM, 100nM siRNA中
各加入transfect reagent 150ul(含5ul lipofectamine)
并静置25-30分钟 (此时为300 ul 混和液)
{add in 6 well}
4. 将前一天已贴在6 well的cell (满度7-8成)，
将旧的medium(含serum和antibiotic)移除，加入1.2 ml serum&antibiotic-free medium
5. 再将300 ul siRNA-lipofectamine 加入
6. incubate 24h後换回正常medium (10% FBS & antibiotic)再incubate 24h
7.抽RNA 转cDNA 测qPCR 看transfect基因的表现量变化。
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整个实验流程大致如上，
但测出来的结果有时siRNA浓度低的组别，基因表现量比浓度高的低....
不晓得是不是上述步骤那些不妥(因实验室没人做过，而我本身大学也不是生物背景)
另外有看到有人说transfection前不可以换medium，不晓得是不是就是我的步骤QQ
请各位大大帮忙QAQ
这部分测完要在後续做cell migration & invasion的实验.....
谢谢>"<
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※ 编辑: swoopsky (111.248.206.128), 02/21/2015 15:32:25
1F：→ blence: 後面还没看,看到你选用的cell,你应该没测试过transfec效率 02/21 19:59
2F：→ blence: 第二会猜想你还未保证该si是可用的,怎先猜transfection? 02/21 20:03
3F：→ swoopsky: Transfect效率有看过是用萤光的方式测，但实验室没有买 02/21 22:10
4F：→ swoopsky: 这样的reagent... 02/21 22:10
5F：推 mesenchymal: 跟别的实验室借GFP plasmid试试 02/22 09:40
6F：推 datro: siRNA 用一般送plasmid的试剂做效率都不太好 有专用的试剂 02/26 00:27