作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
标题[求救] stable clone建立
时间Sun Mar 22 22:43:24 2015
各位版友们好
老板要求我在小鼠小肠上皮细胞的cell line中
用transfect方式来overexpress我要看的protein
老板教的方法是:
1.transfect 24hr 後 分成6盘并加入puromycin 2ug/ml(已确定浓度杀的死
2.selection 约2周
3.直到可用肉眼从10cm plate 底下看到细胞团时
用3~4ul的trypsin 把该细胞团上下pipeting吸起来
转移至24well 中 (这个细胞不容易长成一大坨叠起来 会聚成一片
所以pipet时蛮容易吸到旁边的colony
4.养到6 well後 收lysate与做stock
此时的western结果都清楚的 会有一个很强的band
问题来了
当我重新thaw out这些cell stock时，会持续养在1ug/ml的puro-DMEM中
(老板跟学长说可以
但养了几代後 我的western表现量就越来越低了 之後就没表现了...
於是做了limit dilution 终於拿到有表现的细胞(只有1个clone
而且目前养了2~3个月都没有掉
做growth curve结果是 overexpress这个protein会让细胞长的比较慢
由於只有一个clone 老板希望可以duplicate
因此我又重新transfect 要挑stable clone
结果还是一样....thaw out後养了几代western就没看到表现了
而且几乎是0表现 所以limit dilution(正在做 但不太觉得养得出有表现的)
老板一直觉得是我lysis buffer配错导致protein lysis不出来
我从NP-40-->TX 100--> RIPA(NP40+DOC+SDS)一直换
他觉得我lysis buffer由於另外加了inhibtor
所以NP40浓度会从1%--->0.95% 导致protein lysis 不出来
而我自己是觉得 会不会我挑single colony时 本来就不是single来源
而且有表现蛋白的细胞又长比较慢 所以就慢慢被埋没了
为了建立这个stable clone 半年都快过去了
看着同学的data一直生 自己却一直卡在这里 有点崩溃阿...
有没有什麽挑stable clone的建议呢?
是该在最前面transfect後 直接做limit dilution
以确保clone是单一来源吗? 还是有其他建议 谢谢QQ
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 123.194.138.71
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1427035407.A.713.html
1F：推 tsubasawolfy: 如果那麽确定该蛋白oe会影响细胞生理 怎麽不改诱导03/22 23:17
2F：→ tsubasawolfy: 型表现呢03/22 23:17
3F：推 ararthur: 1%换成0.95%就会lyse不了...是不是你老板在搞你啊03/22 23:58
4F：推 ararthur: protein lysate跑其他蛋白 例如internal ctrl呢 有吗?03/23 00:00
5F：→ ararthur: 如果有那就不会是lysis不完全阿03/23 00:01
6F：→ ararthur: stable clone常常会跑掉 特别是冻了以後 我有做过transf03/23 00:01
7F：→ ararthur: -ect後冻起来就会死掉的细胞... 不行就建议密集把实验做03/23 00:02
8F：→ ararthur: 完不要仰赖冻起来的stock吧03/23 00:02
to T大：我有想过但没跟老板提 他应该会说：“没这个必要吧？”
是说induced的有什麽好处吗？
to A大:我的细胞STOCK後不会什麽死 (超会长) 但表现真的会大下降
因为实验室只有我一个人在用这种细胞 所以问谁都不知道
我试试看细胞一直养到实验做完吧 (前提老板要同意...
另外internal ctrl很正常 我去lyse 之前LD挑出来的clone表现也正常
是新挑的都不表现了 所以我觉得不关lysis bfr的事...
但老板就要我一直重跑western (ry
※ 编辑: tynse71864 (123.194.138.71), 03/23/2015 01:19:05
9F：→ blence: 用lysis buffer的理由好像有点瞎?03/23 09:01
10F：→ blence: 如果要重挑,在puro接近稳定之後种到极稀释,就不会难挑了03/23 09:04
是puro筛个10天左右 继续用原来的plate 种到很稀； 还是改种96well呢？
※ 编辑: tynse71864 (42.66.40.126), 03/23/2015 11:25:14
11F：推 tsubasawolfy: lysis buffer理由超瞎所以完全不想理 03/23 14:26
12F：→ tsubasawolfy: 如果你要继续挑的话看要不要增加一点puro的量 03/23 14:26
13F：→ tsubasawolfy: 接着因为细胞特性的关系不要养到肉眼可见 03/23 14:27
14F：→ tsubasawolfy: 显微镜下可看到一团形成时用glass cylinder挑 03/23 14:28
15F：→ tsubasawolfy: 至於会不会碰到其他的colony...transfection後分稀 03/23 14:30
16F：→ tsubasawolfy: 一点让各colony距离大一点03/23 14:30
※ 编辑: tynse71864 (42.66.40.126), 03/23/2015 16:14:10
17F：→ Ice9: 若没有 glass cylinder，可以自已切 tip 的头……另外，可以 03/24 17:20
18F：→ Ice9: 削尖 tip 尖端用来挑起 colony。 03/24 17:21
19F：推 yuyu219: 比较建议解冻後先用较高浓度的puro，稳定後再调低。如果 03/26 22:46
20F：→ yuyu219: 继续被老师怀疑lysis buffer，你就sonication给他看，不 03/26 22:46
21F：→ yuyu219: 相信protein没有出来 = = 03/26 22:46
to 塔芭莎大(?) 跟ice大: 这样的话我应该就要在非hood下进行挑细胞了耶
这样好吗 (因为曾经长fungus过...) 我在想想有没有折衷的办法
其实会用固定浓度PURO去筛 其一是我之前测试过该浓度可杀死
其二是我拿到的Vector 建议transfect selection就是该浓度
所以我一直没有去调puro 的浓度
我lysis细胞会vortex 5次耶XD 所以该出来的应该都出来了(吧
不然就是degrade光了...
※ 编辑: tynse71864 (123.194.138.71), 03/26/2015 23:13:45
22F：→ Ice9: 不是肉眼可见吗？ 在显微镜下先在dish背面点一下相对位置， 03/27 13:20
23F：→ Ice9: 再回到 hood 中操作啊。 03/27 13:21
24F：→ Ice9: 肉眼可见的 colony 中虽然可能还有一部分 03/27 13:22
25F：→ Ice9: 可能含有还未死透的细胞，但比一开使用trypsin冲刷的强一点 03/27 13:24
26F：→ zoe77101y: 跑看看PCR,会不会只有在基因上只有差异，蛋白不太明显 04/09 01:30
27F：→ zoe77101y: ！？ 04/09 01:30