作者shunminhsu (sharkhsu)
看板Biotech
标题[讨论] Gibson Assembly 无法成功接上
时间Sat Mar 28 11:40:16 2015
目前打算将vector和insert利用Gibson Assembly接上，再transform
到DH5a，但没想到涂盘後都没有长任何菌。因此想要请问各位有尝试
过此法的人，有没有什麽经验、方法可以提出来参考的呢!?
primer设计完，并利用snapgene确认可ligation後，
把vector double digestion(NcoI、DraIII)、insert 分别切胶纯化
vector 长度为3200bp、insert为2500，两者跑胶确认无误。
按照NEB的protocol :
vector 实验中加入 2μl (50ng)
insert 4μl (150ng)
Gibson buffer 10μl
DIW 4μl
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Total : 20μl
之後再50℃反应15 min → -20 ℃保存，以准备transform用。
Transformation :
上述溶液稀释4倍，将2μl加入50μl的胜任细胞，混合完冰浴30moin
→42℃热休克30 s → 冰浴2 min → 加入950μl LB後於37℃培养1hr
→ 200 μl菌液 涂到palte上(抗amp) → overnight培养
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步骤大约如上，但还是没有长任何菌 ..之前有将gibson完的溶液跑胶，
却只有看到2800 bp的一条band，也不晓得问题出在哪! ..
可否请高手分享相关的经验呢!?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 114.35.165.133
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※ 编辑: shunminhsu (114.35.165.133), 03/28/2015 11:41:19
1F：→ Ice9: 切胶纯化是用什麽方法？最後 DNA 回溶在什麽 buffer 中？ 03/28 18:47
2F：推 Ice9: 跑胶图片可以放上来吗？只有一条band表示另一段坏光了？ 03/28 18:59
呃. . 步骤主要是利用binding buffer将胶片溶完後，再利用spin column和washing buffer
洗净。 回溶是用EB .. 目前身上没有胶片图 囧" 对於另一段坏光目前是没有想法..
毕竟分开跑都有band .. 但一起跑就出现2800bp，最有可能就是此产物为线性...
※ 编辑: shunminhsu (36.239.40.203), 03/28/2015 20:21:47
3F：推 Invec: 两片段请用水回溶 50度C作用完的产物直接取10ul去转 03/29 00:34
谢谢您的建议，我会再试试看
4F：推 penguinbb: vector cutting离recombine的地方多远？我之前经验是若 03/29 00:35
5F：→ penguinbb: 两者离得太远(>几十bp)enzyme作用时间要长一些才能成功 03/29 00:36
6F：推 penguinbb: *cutting site 03/29 00:42
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 03/29/2015 08:21:39
7F：→ Ice9: 我没用过这Gibson Assembly。Invec和penguinbb的方法都很实 03/29 10:58
8F：→ Ice9: 用，毕竟你的 insert 颇大。或许作用时间加长会有效。DNA 回 03/29 10:59
9F：→ Ice9: 溶最好是在水中，以免 buffer 影响酵素活性。如果怕量不够， 03/29 11:01
10F：→ Ice9: 可以一开始就用大一点的量。另外，以前传统方法中，ligase 03/29 11:02
11F：→ Ice9: 作用时都会加ATP，作用後也会放72℃来 heat inactivated。可 03/29 11:03
12F：→ Ice9: 以增加点 transformation 的成功率。 03/29 11:04
13F：→ davidhthy: 好奇问72℃ heat inactivated效果会好到有差异吗@@ 03/29 19:56
14F：→ davidhthy: 是为了不让ligase不乱抓plasmid?? 03/29 19:57
15F：→ Ice9: 记得 datasheet 上写 10%。但没有仔细比较过。 03/29 23:32
16F：→ Ice9: 我刚刚看过 protocol，计算了一下你初始 DNA 的量。似乎少了 03/30 00:14
17F：→ Ice9: 一到两个数量级。另外，50℃作用可以再延长些。 最後再问一 03/30 00:15
谢谢ice大热情的回答，因为protocol上建议vector的量大约在50-100ng之间，所以
我才加50ng进去，insert是建议>vector2倍以上，所以才加150ng...。
目前只能先试试看将片段回溶於水中和拉长反应温度了。
18F：→ Ice9: 你的 DIW 是什麽？厂商没卖这东西啊。 03/30 00:16
19F：→ blence: DIW(deionized water)不少cloning jit会附 03/30 00:30
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 03/30/2015 08:53:06
20F：推 silverberry: 最近做了两个 constructs (7+7.8/7+4.3 kbp) 04/16 13:29
21F：→ silverberry: 我同时用 Gibson Assembly 和 In-fusion 做， 04/16 13:29
22F：→ silverberry: 结果 in-fusion 大胜。目前正在等定序结果。 04/16 13:30
23F：→ silverberry: 如果你的 overlap 是 15 bp 的话可以考虑换 kit 试试 04/16 13:31