作者shinchenboy (欣承男孩)
看板Biotech
标题[求救] PCR product 定序
时间Mon Apr 13 16:22:56 2015
各位版友大大好
最近小弟在做PCR定序的实验
想检验我PCR的产物是否如自己预期想P出来的片段
PCR产物的片段约200bp
做法是PCR之後跑胶 然後从胶中萃取并纯化DNA
根据跑胶的结果发现位置如自己预期是在200bp的位置
从胶中萃取PCR产物後的DNA总量约900ng 浓度30ng/ul A260/280在1.8左右
然後送到学校的共仪去做定序
送定序的DNA sample我取总量15ng配成总体积5ul 再外加1ul的primer(6uM)
定序的Primer我是直接用PCR Forward的Primer
最後出来的结果 一开始定的序列既不正确也很奇怪(就是一堆乱码...)
大概是到了第30~40个bp後定出来的序列才跟我的预期是一致
简单来说就是前面30~40个bp序列是不对的(参杂乱码)
之後的序列就都跟预期的一致
我想问说就是这样的情形可以说是我PCR定序的结果是成功的吗
根据实验室学长的说法好像定序一开始出来的序列的不太可信
还是说我要用Reverse的primer来定反股来做一个双重的验证???
想请教各位有经验的大大们了~~~感谢
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1F：→ blence: 是看ab1档还是txt档？ 04/13 17:00
2F：推 ayumi7667: 定序请设计另一条引子 以pcr引子定前几个字会不准 一 04/13 17:09
3F：→ ayumi7667: 般定序公司会有说明 04/13 17:09
4F：→ shinchenboy: 两种档都有看 不过两种档的结果不是都一样吗??? 04/13 17:32
5F：→ blence: ab1其实可以人工判读看出seq是不是真的有异 04/13 17:54
6F：推 jabari: 好一点还可以看heterozygote XD~ 04/13 18:12
7F：→ Ianthegood: 本来就会这样 前50个mer讯号都会乱七八糟 04/13 18:28
8F：→ Ianthegood: 想看前面大概都会送进sequencing vector里面 04/13 18:28
9F：→ roy047: 可反方向定回来即可知道最开头序列 04/13 18:54
10F：→ lail: 这是正常的，所以你需要再从另一端读回来 04/13 19:58
11F：推 soend: 正常的 不然就做个TA clone即可 04/13 23:02
12F：→ Ice9: 这是正常的。primer 後大约 20~30 mer 讯号本来就会差。 04/13 23:12
13F：→ Ice9: 想知道完整序列，可以选 Ianthegood 或 roy047 的方法。 04/13 23:14
14F：→ Ice9: 另外，看预列还是用波状图(ab1?)档比较精确，文字只是辅助。 04/13 23:15
15F：→ Ice9: 文字有时会出错，你得回去看图形档判断。 04/13 23:16