作者freakshow (freakshow)
看板Biotech
标题[求救] Bisulfite PCR
时间Sun Apr 19 16:13:51 2015
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立 正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
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最近在做Bisulfite PCR
目的是处理过Bisulfite的gDNA要用PCR放大 把片段纯化做TA+sequencing
目前是抽完gDNA 260/280有1.9 260/230有1.8
拿500ng gDNA做置换!
我是用EpiTect Fast bisulfite conversion kit(Qiagen)
Q:
1. 请问我该取多少ng的biDNA去跑PCR
以及我该用Hotstart Taq做吗?
2. Bisulfite-PCR 的primer设计有推荐的网站吗?(目前是用Methprimer..)
上面那设计出的primer有做过一轮 完全没band...
3. primer的长度,Tm值 有比较建议的吗?
4. PCR 的protocol有针对biDNA比较好的温度时间吗?
ps.我们实验室没有学长姐会做这实验 老师也只叫我做 没辙阿!!!
谢谢!!!!!!!!!!
(被苦恼已久的小小研究生敬上!)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.213.20
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1429431234.A.433.html
1F：→ freakshow: 附注: 不是bisulfite MSP 是biPCR! u跟m都必须P出产物 04/19 16:15
2F：→ freakshow: 先前有google到一个bisulfite的超详细说明 里面说prime 04/19 16:21
3F：→ freakshow: r要加M13tail 但我加了还是P不出来...Tm也变62超怪 04/19 16:22
4F：推 Bows: 自己设计阿，methylprimer只是参考用的，你只要避开CpG就可 04/19 16:46
5F：→ Bows: 以U跟M都p出来了，我们家主要还是以50/50 CG/AT 04/19 16:47
6F：→ Bows: 然後是用hotstar Gotaq再跑，另外假设primer在CpG site上的 04/19 16:48
7F：→ Bows: 话，也可以用 Y (C or G) 下去抓，不过这样杂band会比较多 04/19 16:49
8F：→ Bows: 另外DNA的量要看你的primer specific 04/19 16:50
9F：→ Bows: 我们是转300ng ，PCR用2去跑，有些primer会很浓，但有些 04/19 16:50
10F：→ Bows: 用2跑会太但，所以就用4~6去跑这样 04/19 16:50
11F：→ Bows: *转300ng elute 10μl 04/19 16:51
12F：→ freakshow: 50/50 CG/AT看不懂..另外想知道产物要设计多少bp最佳? 04/19 17:53