作者s64123 (嘿嘿)
看板Biotech
标题Immunofluorescent 一直染不出来
时间Sun Apr 26 16:27:53 2015
想询问各位大大
冷冻切片後
我染特定细胞的 receptor (tyrosine kinase receptor)
但染完都没有我要看得细胞
应该说 POSITIVE 跟 NEGATIVE 是同样亮度的
步骤如下
0.01 M PBS wash 5min*3
2% NGS-0.1% BSA- 0.2% Triton blocking 5 mins
10 % NGS-0.1% BSA- 0.2% Triton blocking 20 mins
0.01 M PBS wash 5min*3
add primary antibody overnight at 4 度C
0.01 M PBS wash 5min*3
add secondary antibody 30 mins
0.01 M PBS wash 5min*3
coverslip
一抗是新买的
想请各位知道哪里出问题吗?
感谢 > <
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立 正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
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1F：→ stone1105: 1跟2抗浓度是? 有时候抗体浓度调整一下会好很多 04/26 17:05
2F：推 bpjp: 二抗之後有严格避光吗？你没写到 04/26 21:14
3F：推 bpjp: 不对，有亮就跟避光没关系了 04/26 21:15
4F：推 tz2733: 为何使用triton? 要染的蛋白在细胞内? 04/26 21:38
5F：推 tynse71864: 丢一抗之後的wash 我都会用PBST耶 04/26 23:27
6F：→ tynse71864: 你的negative ctrl是 只有二抗 还是加IgG 04/26 23:28
7F：→ s64123: 加二抗 04/27 08:16
8F：推 Tubar: 1.可能你的一抗efficiency不好，好的抗体让你上天堂，烂抗 04/27 10:15
9F：→ Tubar: 让你染到头抱着烧 2. 可能此细胞内receptor表现量少，所以 04/27 10:15
10F：→ Tubar: 你会看不到，可以试试市面上放大讯号的KIT 04/27 10:15
11F：→ blence: 推楼上,原po未提及此一抗用在IF是已知的,也未说明postive 04/27 11:01
12F：→ blence: 是否来自已知的细胞,这两个因素比调整condition来得重要 04/27 11:02
13F：→ s64123: 但很多文献资料都表示此一抗是确定可以染出我要的细胞的 04/27 11:09
14F：推 Tubar: 你目前的做法看起来没有太大的问题，我认为主因还是在Ab和 04/27 12:23
15F：→ Tubar: Ag上，朝这两个方向去做troubleshooting 04/27 12:24
16F：→ s64123: 谢谢大家 04/27 13:05
17F：→ ad1980: 一抗有用在 WB 上试过吗？ 04/30 02:27
18F：→ s64123: 有 很明显!! 05/01 22:13
19F：推 jabari: 要说细一点的话..你用了triton破膜 但後面没用tween20让 05/02 16:52
20F：→ jabari: 孔洞维持..可以洞洞缩起来了?? 05/02 16:52