作者ct13732 (独孤求败)
看板Biotech
标题[求救] t a clone 问题
时间Tue Apr 28 11:30:28 2015
t a clone 实验步骤 请教各位前辈
insert 1700bp 使用yeastern t and a vector 2728 bp
rt-pcr 产物 切胶 萃胶
开始做a tailing(使用phire 的tag )
5x GC buffer 6ul
2.5mM DATP 3ul
dna 含量 20ul 72c 30m, 12 overnight
phire 1ul
之後在使用 QIA quick pcr purifcation kit 纯化後
检测核酸的含量 OD value 约在35-55 ug/ml
ligation(使用biolabs t4 ligase)
ta vector 2(50ng)
t4 ligase 2
dna 3(150/55) 16 度 overnight
dw 补到20
t4 ligase 2
之前有测试过1:3 mole 1:3 1:5 重量比
发现在重量比的箘长的比较好 之前学姐也是如此
所以一直都是使用重量比 莫尔数比的箘很少
选用dh5-a competent cell 接5ul 增箘1.5hr 涂盘（lb+amp 100mg/ml ）
隔日进行colony pcr 选用13f+自行的primer
colony pcr 结果在目标的产物有很浅很浅的band 要肉眼看胶片才看得出来
但抽完plasmid 定序发现都没有insert 进去 每次定序都是vector
箘长的50 个菌落以上（涂盘使用65ul）
但似乎都没有insert 进去
想请教前辈 要如何知道是a tailing 成功？ 不然每次都重做一次很耗时
（我有大量的样本）
我有请学姊跟我一起操作过 确认实验技术没有问题 用别的样本也有成功
但是这一段就还没有成功 卡关快半年了 觉得心灰意冷
想请问各位前辈有什麽要改进的地方？
若我实验成功一定大大的感谢你
若你离我很近 请让我请你喝新巴克QQ
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1F：推 williamyang: blunt end PCR产物推荐用pjet1.2 vector,很好用 04/28 11:58
2F：→ Ice9: 你的insert或vertor，得至少有一个5'-end有phosphate group 04/28 12:04
3F：推 smallhowhow: A tailing taq处理 72c 3hr 04/28 12:04
4F：→ Ice9: 另外，抽完 Plasmid 怎麽会直接拿去定序呢？跑个胶先看看才 04/28 12:09
5F：→ Ice9: 对啊。你insert：vector很接近，在胶体上很容易分辨出来的。 04/28 12:09
6F：→ Ice9: 还有，你在 ligation 步骤中，加了多少 ligase？ 04/28 12:14
7F：→ Ice9: 要不然就是使用会在 3'-end 自动加 a-tail 的 polymerase 04/28 12:17
8F：→ Ice9: 对了，也有可能是 ligase 的问题。ligase 非常 labile，以前 04/28 12:24
9F：→ Ice9: 实验室刚买来，就先用冰的tube分装4或5λ，编号冰起来，依序 04/28 12:29
10F：→ Ice9: 从-20℃取出使用。 04/28 12:31
11F：→ Ice9: 还有，ligase处理完，可以用65或72℃处理5 min…… 04/28 12:36
12F：→ Ice9: 最後，OD value 它就不会是浓度单位。你的叙述要再修改。 04/28 12:38
13F：→ blence: 这个protocol好奇怪,你有大量样本更不需这麽麻烦的作法 04/28 13:14
14F：→ blence: 直接用pJET那套就省事多了 04/28 13:16
15F：推 jabari: 有钱买topo啊 QwQ 04/28 14:49
16F：→ ct13732: 回ICE9前辈 我加了2ul ligase，想请教抽完plasmid 跑胶是 04/28 17:14
17F：→ ct13732: 是用酵素re切跑胶麻？还有谢谢od的指正，我想表达的是浓 04/28 17:16
18F：→ ct13732: 度的部分，我使用的是pfu tag 所以需要加a tailing 04/28 17:19
19F：→ ct13732: 那我要怎麽确定我的产物端有磷酸化？ 谢谢前辈 04/28 17:22
20F：→ ct13732: 回williamyang blence 谢谢你的建议 因为这一方面的经验 04/28 17:25
21F：→ ct13732: 验没有很多 我会好好研究一下 谢谢你们 04/28 17:26
22F：→ blence: 文中没提,你的colony没有蓝白挑过？ 04/28 17:58
23F：→ ct13732: 回blence前辈 没有 实验室学姊的步骤就是我上面步骤的 04/28 19:33
24F：推 supray: PCR product 50ng/ul 取1ul跑胶 不会只有很淡的band 04/29 09:18
25F：→ supray: 或许你的产物不够专一 04/29 09:19
26F：→ supray: 咦 我漏看了 怎不做蓝白筛呢？ 04/29 09:23
27F：推 chaunen: 设计跨vector inser 的primer 做colony PCR 不然就蓝白筛 04/29 17:46
28F：推 chaunen: 其实ligation完可以先PCR看看是否有接进去 04/29 17:51
29F：推 chaunen: 同步做先前成功的样本 当做整个过程的postive control 04/29 18:22
30F：推 chaunen: 如果RT-PCR完的产物只有1种or目标产物最多 直接clean up 04/29 18:44
31F：推 chaunen: 甚至Pfu完直接加1ul taq 做3'端的A之後再clean up(要试) 04/29 18:55
32F：→ chaunen: 跑胶切胶的步骤应该是可以省略的 04/29 18:57
33F：→ chaunen: 很淡的band应该都是伪阳性 猜primer没有跨vector& inser 04/29 18:59
34F：推 chaunen: 沾菌的时後取到微量涂盘时的linear vector 04/29 19:08
35F：→ ct13732: 回前辈chaunen 谢谢你的建议 我会先ligation 跑跑看 05/01 16:51
36F：推 tigernaxo: 要不要试试用kinase处理insert 05/01 22:47