要说的东西太多了，於是索性回文一章。 1. 5'-end phosphate group 你的 PCR product 肯定没有。 至於 vector，要看你手上的 datasheet 是怎麽写的。 没有 5'-end phosphate group, 你加 ligase 也没用。 要是 vector 有 phosphate group，会大增 vector 自接的可能性。 我以前用过的是 pGEM-T 系列来做 T-A cloning， 上头的 protocol 有说可以不必再进行 vector 的 dephosphorylation， 显示 pGEM-T vector 上是有 5'-end phosphate group 的。 它是说 backgroup 低，但低到多少，似乎没提。 Insert DNA 可以在量产并纯化後，拿 T4 polynucleotide kinase， 在 5'-end 进行 phosphorylation。 如果你们的 protocol 没有进行过修订，那表示以前有成功过，而且可 能经常成功， 那表示你们一直使用的 vector 应该是有 5'-end phosphate group 的。 然後再看看你的结果描述，那个 background 有点高…… 2. blunt end ligation 这是另一个建议。 以前做的是切 pGEM-3z，在 SmaI 的 RE site，再 dephosphorylated。 而 insert 一律 PCR 量产纯化後做 5'-end phosphorylation。 实验室的处理过的 pGEM-3z vector，放在 -20℃ 超过五年後使用一样 没问题。 作 blunt-ligation，我常加 PEG (final： 5% w/v)，但加了 PEG 就 不能做 heat-inactivation，所以，有时候这两者会换着用。 3. 挑 colonies 以前挑 colonies，一定是确认有 insert 後才送定序。那个价钱差老 多了。除非 insert 长度太短，否则挑菌养养，跑 gel 看看有没有 band shift 现象，也就是和 vector alone 的 clone 进行 gel 位置的差异比对。 你的 vector size 才 2.7 Kb——唔，和 pGEM-3z 差不多嘛—— insert 就有 1.7 Kb，那差别非常大，在 gel 上是一目了然，用不着拿 RE 切就看得出来。 赶一点的，一大早养菌，傍晚就拿得出结果，可以准备拿可能的 clone 去定序。要不然，用 tips 挑 colonies，一边 PCR 等结果，一边拿 tips 去养菌…… 像是你在做的，如果要挑的菌太多，那用 colony PCR 会比较节省时间 没错。但是 colony PCR，里面东西太脏，如果 PCR condition 和 primers 不太好，那很容易误判。你可以说明你在 colony PCR 用的 primers 是什麽 吗？还有你 colony PCR 的 condition？ 4. Ligation Ligase 很贵的，看到你文章的内容，我还以为你一共加了 4ul 的 ligase。 一般我都只用 10 ul 来作用，然後 transform 时全下了 (约 100 ul 的 菌)。你拿 20 ul 作用，只取 5 ul 做 transformation，那剩下的是要 拿来干什麽？拿来下次 transform 吗？你觉得差不多三倍体积，结果会 差很多吗？ T4 ligase 在作用完後，我们都会用 65℃ 来 heat-inactivation，除 非还另外加了 PEG。 T4 DNA ligase 因为颇贵又很脆弱，所以，刚买来时，我们实验室一定 取冰过的、并且编号过的 vials，以 4 或 5 l 分装冰入 -20℃ 冷冻保 存，要使用就登记依序开瓶。 5. 换 DNA polymerase 你既然有了已加 T-tail 的 vector，何苦还花时间自己在 PCR product 上加 A-tail？这个多出来的一步，还指不定是你 construct 的 rate- limiting step 呢。 用(买？)会加 A-tail 的 DNA polymerase 吧。反正你现在的要求是要 先接进东西。我记得一般 Taq 好像都会加 A-tail，但量产时有颇高的 SNP 出现？但出错机率其实没想像中的高，能高到 1/1000 就要偷笑了。 就算出错，可以再设计个 site-directed mutagesesis 把它修正回来， 顶多是多买一到三组 primers，比你一直搞半天的想塞却塞不进东西好 太多了。 以上是我的意见，希望能帮得到你。 --

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