作者babylikeg (殒落星痕)
看板Biotech
标题[求救] plasmid中特定基因片段置换?
时间Fri May 1 11:28:41 2015
最近boss想做一个project
主要是研究某段基因对於药物抗性的影响
实验中用到的质体
属於T5 promoter
其中的antibiotic resistance gene属於Amp resistance
但本身我们在做Drug resistance的目标也是Beta-lactam
筛选所使用的抗生素会影响实验结果
想把amp 抗性换成 其他抗生素筛选基因
苦於小弟没做过mutagenesis...
boss也不太愿意添购新的plasmid
想请问一下板上先辈，有甚麽方向可以尝试?
可以点出，小弟再去搜搜看相关文献方法来尝试!
感谢各位提点
祝各位顺顺利利的~实验也都有好Data!!!
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教授念经何时了 靠妖期末考
室友昨夜又春风 好人不堪回首数卡中
学长笔记应犹在 只是课本改
问吾能有几多囧 不多不少正好五十九
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 163.20.181.88
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1F：→ milkpa: 实验室有抗其他抗生素的plasmid吗，拿来换一换就好了 05/01 11:49
2F：推 licat: 查有没有适合的酵素切位把amp gene切掉 接别的进去就好 05/01 11:51
有Kanamycin、chloramphenicol的抗性载体
amp resistance前方紧黏T5 promoter
还是只要把AMP部分截掉就好了??
※ 编辑: babylikeg (163.20.181.88), 05/01/2015 12:03:02
3F：推 liuse: 没RE的话可以设计homologuous recombination换进去 05/01 15:01
4F：→ liuse: 但要在特殊E. coli strain 05/01 15:02
5F：推 eric1210: 先把map调出来 ，应该会有可切掉amp的位置 ，切掉後由 05/01 15:11
6F：→ eric1210: 其他plasmid的抗生素片段来塞进去 05/01 15:11
7F：→ eric1210: 切掉amp部份就可以 ，T5不用 05/01 15:12
8F：→ Ice9: 我想到的是类似 liuse 的作法：将Amp vector 和要制换的XXX 05/01 17:23
9F：→ Ice9: vector 放在一起。设计 forward primer 前半段在 amp vector 05/01 17:24
10F：→ Ice9: 上，後半段在 xxx 抗生素的 5'-end 上，然後 reverse primer 05/01 17:25
11F：→ Ice9: 的前半段在 amp 3'-end 之後的原 vector 上，後半段在 xxx 05/01 17:26
12F：→ Ice9: 抗生素的 3'-end 上，当然要比一般 primer 要长一点。然後拿 05/01 17:28
13F：→ Ice9: 去 PCR amplify。最後3种 plasmid 的大小应该有差，切胶分离 05/01 17:29
14F：→ Ice9: 要不然拿 DpnI 处理过是最好。 05/01 17:31
15F：→ Ice9: 最後再拿去 transform 量产和定序。 05/01 17:32
16F：→ Ice9: 咦，不对，这样会有四种 plasmid 。把 xxx vector 先用RE切 05/01 17:34
17F：→ Ice9: 到包含 xxx 抗生素 DNA 的最小片段，分离纯化，再和含 amp 05/01 17:35
18F：→ Ice9: 的 vector 放在一起进行 PCR 量产。 05/01 17:35
19F：→ blence: 我用过上面的方法塞入最长1.5k,同时踢掉几10bp,不过是先放 05/01 18:36
20F：→ blence: 大xxx後先纯化,再以此当primer以site direct去换amp vectr 05/01 18:41
21F：→ Ice9: 我自己没塞过东西，而是用类似的方法进行同一段 DNA 上不同 05/01 22:31
22F：→ Ice9: 片段的置换，所以想说以前的方法，原 PO 可以考虑。blence 05/01 22:34
23F：→ Ice9: 的方法更简单，但我们两者的 primer 设计应该是一样的。 05/01 22:36
24F：→ Ice9: 而 blence 的方法应该会能省 primer 的设计长度。 05/01 22:40
25F：推 e104582001: 感觉买新plasmid会比同源互换较多钱XD 05/02 03:14
26F：→ e104582001: *省 05/02 03:14
27F：推 chaunen: 可以先上addgene找看看有没有适合的 05/02 11:03
28F：推 jeol1620: 可以试试看PIPE cloning 可以做deletion,insertion 05/06 22:01
29F：→ jeol1620: 放新的基因要4条引子，deletion,insertion两条就够了 05/06 22:03
30F：→ jeol1620: 两条引子P完用dpnI背景切乾净直接电穿孔，只是变没抗性 05/06 22:05
31F：→ jeol1620: colony PCR要多筛一点 05/06 22:05
32F：→ jeol1620: Ice9大大说的感觉是RF-cloning 05/06 22:06