作者baal90317 (梦梦梦梦想家)
看板Biotech
标题Fw: [问题] 关於整个qPCR的trouble shooting
时间Sat May 16 11:10:34 2015
※ [本文转录自 Biology 看板 #1LLhJMb3 ]
作者: baal90317 (梦梦梦梦想家) 看板: Biology
标题: [问题] 关於整个qPCR的trouble shooting
时间: Sat May 16 11:09:08 2015
【问题】：从细胞中取RNA到转成cDNA到最後跑qPCR可能出问题的步骤和确认方法
【问题起因】：1.qPCR出来的结果不太正常,要如何学习去找出问题的根源
首先 取RNA时 要先确保RNA不会被降解 过程中的小细节不提
取完之後到跑qPCR之间 有哪些方法可以知道自己取出来的RNA有没有
问题呢?
2.用kit(invitrogen)取出的RNA 280/260的值很好(~2.0)
可是260/230却很糟 (~0.5)过程我也没用有机溶剂
用kit的可以用酒精洗吗?
【个人看法】：取完之後先用nanodrop看 280/260 和 260/230的 O.D.值
但是就算O.D.值没有问题 RNA有可能断成小片段而不知道
导致最後qPCR的结果不好 (melting curve没问题)
因此中间可能要用跑胶的方法去确认RNA的完整性 但是我大学科系
非生科背景 原理懵懵懂懂 不知道跑胶该设那些组别来跑
跑cDNA和跑RNA各有那些优缺点也不知道 学长姊也都非生物背景
大致上都不知道 (是生物背景的也没做PCR)
可以请各位给些建议看的书籍和一些建议吗? 谢谢!!!
【参考资料/连结】：
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.113.136.221
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※ 转录者: baal90317 (140.113.136.221), 05/16/2015 11:10:34
1F：→ jabari: 啥?? 你的问题是?? 05/16 17:04
2F：推 jabari: 用kit260/230的问题 根本原因是你加wash buffer时没有转一 05/16 17:06
3F：→ jabari: 转. 这在protocol没有写 但在网路已讨论很久. kit里面盐 05/16 17:07
4F：→ jabari: 的部份残留column内 所以在wash步骤稍微让整个管壁都浸润 05/16 17:07
5F：→ jabari: 到buffer.最後260/230就会正常 05/16 17:07
6F：推 jabari: 另外想知道有没问题 你该选用qubet或是上agi2100看RIN值 n 05/16 17:09
7F：→ jabari: anodrop其实看不清RNA的品质 05/16 17:09
8F：→ jabari: 如果真的想读 我建议你翻实验室NEB旧的catalog 05/16 17:10
9F：→ jabari: 或是看protocol online 里面积满古人的血泪 05/16 17:14
10F：推 huuban: 一般的跑胶很够了啦，不过如果有钱用2100当然最好 05/16 18:57
呃 大概是 如果怀疑取出的RNA可能被RNAase切成小段
在跑PCR之前要用什麽方法来确认会比较好呢? 谢谢!
大致上是知道要跑胶 只是要怎麽跑会比较好呢 @@
什麽是primer的postive control.. 谢谢
※ 编辑: baal90317 (111.243.65.124), 05/16/2015 20:49:03
※ 编辑: baal90317 (111.243.65.124), 05/16/2015 20:51:46
11F：推 tigernaxo: 怎麽跑？不就跟DNA一样 看rRNA还在不在 05/18 10:08
12F：→ sylvialalala: 怕rna断成小片段的话，跑胶看有没有smear 05/18 10:12