作者daffinger (daffinger)
看板Biotech
标题[求救] western blot位置不对
时间Wed May 20 00:01:21 2015
最近做western,好不容易终於看到band了
但是发现跟网页上的位置不同
网页上大概55Kd，我的大概落在40Kd
control组跟treatment组都一样(所以应该不是因为加药造成修饰的问题)
band很明显也没有杂band
请问是蛋白质degraded吗?(加sample buffer煮5min，冰-80度)
还是煮蛋白的温度太高(大概有95度以上，根据别人的方式)?
RIPA的反应时间太久会这样吗?(4度放了有一个小时)
有爬文说marker不一定准，要看loading control (是这样吗?)
新手发问，请多见谅
谢谢
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1F：→ blence: 现在多数公司的抗体sheet有一定比例的size是错的 05/20 00:27
2F：→ blence: 请用genecard等网站查询物种标准MW或再si等以确认位置较好 05/20 00:30
3F：→ Ice9: isoform (tissue-spicific)? 05/20 00:31
4F：推 ararthur: datasheet不要太过相信 各种modification, isoform, 05/20 13:18
5F：→ ararthur: conformation, dimer等 都有可能出现位置不符 05/20 13:19
6F：→ Ice9: marker 和 SDS-PAGE 浓度也会影响判断。 05/20 13:56
7F：→ Ice9: 还有 protein 有没有被修饰也会是位置不同的原因之一。 05/20 13:57
8F：→ blence: 实验技术上的错误是可以接受的,位置不同的解释,abcam每支 05/20 14:11
9F：→ daffinger: 发现gapdh也大概差10Kd左右，请问marker会有问题吗? 05/20 14:12
10F：→ blence: 目录也都有位置非预期的解释,但其实不少问题是各家公司自 05/20 14:14
11F：→ blence: 行剪贴别家OEM的产品,把含tag讯息移除等,非实验的错误 05/20 14:16
12F：→ blence: 原po会不会是prestained都是蓝色,整个marker位置都错估 05/20 14:17
13F：推 ararthur: marker用两个牌子平行一起跑看看吧 05/20 14:39
14F：→ ararthur: 我的经验是 marker不准也不会差太多 特别是你的size也还 05/20 14:41
15F：→ ararthur: 在常见range之内 过大或过小的band MW比较容易差的大 05/20 14:41
16F：→ Ice9: 你把图放上来看看吧。另外，可以详加说明实验条件吗？ 05/20 17:13
17F：→ daffinger: 谢谢大家，我下次先换一个marker试试看 05/20 18:05
18F：→ cmid05: 我前两天 害我剪到band 05/24 23:10