作者shinchenboy (欣承男孩)
看板Biotech
标题[求救] pcDNA3.1(+)stable clone建立
时间Thu Jun 11 13:32:36 2015
各位版友大大们好
最近小弟的实验要开始建立以pcDNA3.1(+)为载体的Stable clone MCF7细胞株
建立的方式参考学长姐的实验记录以及pcDNA3.1(+)的产品资讯
主要的方法是先把pcDNA3.1(+) transfect到MCF7细胞之後
隔24小时後有收一些细胞下来观察transfection有无成功
然後剩下的细胞则是继续培养在含有抗生素G418的medium中
来筛出stable clone出来 每2天要换一次medium 大约要筛2周
G418最後在细胞中的浓度是1ug/ml(此浓度是参考毕业学长姐的论文)
根据RNA定量的结果证实transfection是有成功的
但是剩下来培养在含G418的细胞却发生以下的现象:
1.一开始刚加G418的时候好好的，隔天看细胞发现细胞有凋亡大约5成，再隔天看
发现细胞凋亡大约到7成了...(存活下来的细胞只剩3成)
2.後来我换了一次medium，重新加入G418，隔天再看一次细胞，发现已经凋亡了约9成
，再隔天看一次细胞，发现存活下来的细胞屈指可数......
想要问版友大大们这样的现象是正常的吗?
我的理解是加入G418最主要的目的是为了要杀掉没有被成功transfect的细胞
让有成功transfect的细胞存活下来
但是今天我的细胞再加入G418後几乎都死光光了
可是从RNA定量的结果来看我pcDNA3.1(+)应该是有成功送入MCF7才对
所以会不会是以下两个问题
1.G418加入的浓度过高:加入的浓度条件是我参考学长姊的毕业论文，他们用的plasmid
和细胞都和我一模一样，所以我想说这个浓度应该是很适当的才对
2.选用的抗生素不恰当:pcDNA3.1(+) vector内包含抗Neomycin的基因，G418是Neomycin
的衍生物，所以我想说应该也不是这个原因才对
拜托了各位大大们 小弟会感激不尽
小弟我好想要赶快毕业阿QQ
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1F：→ a90648: stable clone是指你送进去的plasmid有插进genome中 06/11 13:58
2F：→ a90648: 数量本来就不会太多了，不会你的细胞我没使用过所以不知道 06/11 13:59
3F：→ a90648: 一般状况下成功率有多少 06/11 13:59
4F：→ a90648: 而且你一开始送进去後抽RNA转RT去看结果基本不准 06/11 14:00
5F：→ a90648: 即使有处理DNaseI还是有很高机会去P到plasmid 06/11 14:01
6F：→ a90648: 要确认的话我们实验室一般是用western或是co-transfect 06/11 14:04
7F：→ a90648: GFP plasmid 06/11 14:04
8F：→ a90648: 细胞有亮基本上就表示有transfect成功，但是要变stable 06/11 14:05
9F：→ a90648: 还是会因为细胞不同成功率会差很多 06/11 14:06
10F：推 FYT0429: G418的使用浓度你可以先用96孔盘来测试， 06/11 14:48
11F：→ FYT0429: 找到lethal concentration再往下调100~200 ng/ml 06/11 14:49
12F：→ FYT0429: 有时候这些东西在不同人手上就是不一样，玄玄der 06/11 14:49
13F：推 MDCCLXXVI: 用G418 ok 06/11 18:50
14F：→ blence: 你把transfection成功当做是stable candidate了,其实差异 06/11 19:22
15F：→ blence: 很大,如果G418加了不会死,那当初就不需特别用G418筛了阿 06/11 19:24
16F：→ blence: 你这里的G418不只是杀"没有被transfect"的细胞,而是要杀 06/11 19:29
17F：→ blence: non-integrated"的细胞,所以才会被称为stable clone 06/11 19:31
18F：推 wanderchang: 私以为stable clone 至少是一个月的事？需要让时间 06/11 20:30
19F：→ wanderchang: 把transient， not-so-stable 跟stable clone区分开 06/11 20:30
20F：→ wanderchang: 来 06/11 20:30
21F：→ Ice9: 你的问题2很严重啊。我觉得有些东西你不弄清楚，还是缓点毕 06/12 08:51
22F：→ Ice9: 业的好。 ps. 一个是 phosphotransferase 一个是antibiotic 06/12 08:55
23F：→ Ice9: 啧！抱歉，我眼残了。自打脸～～ 06/12 08:57
24F：→ Ice9: 我个人是觉得你transfection可能并没有你想像来得高。一是用 06/12 09:02
25F：→ Ice9: a90648网友说了的，你测试的手段太单一，而且可信度可能不大 06/12 09:03
26F：→ Ice9: 二是你的control组的死亡率如何？我猜也和你的实验组一样的 06/12 09:04
27F：→ Ice9: 速度。这样可能问题并不在selection本身，而是细胞有问题。 06/12 09:05
28F：→ Ice9: 而且，用1ug/ml 来筛选，压力太小了，如果tranfect成功，不 06/12 09:06
29F：→ Ice9: 太可能一开死就死一大票。1ug/ml比较像是maintain时的浓度。 06/12 09:07
30F：→ blence: 我猜是写错了,应该是1mg/ml,就算maintain也至少要50ug/ml 06/12 10:18
31F：→ blence: 我们MCF7用的是300-500ug/ml这个范围 06/12 10:19
32F：推 MDCCLXXVI: 质体的品质ok吗？浓度有跑胶确定吗？有时机器测不准 06/12 12:21
33F：推 chaunen: 推楼上~若质体supercoil的比例低, transfect的比例会大降 06/13 01:38
34F：→ chaunen: 若表现的是原先MCF7没有的基因, 跑QPCR会很明显 06/13 01:39
35F：推 chaunen: 即使只有少数的细胞有表现 06/13 01:43
36F：推 chaunen: 可以1.test transfection condition (拿个表现GFP的质体) 06/13 01:48
37F：→ chaunen: 2.同M大 检查质体quality(100ng 跑个1% agarose gel) 06/13 01:52
38F：→ chaunen: 3. 正在select的MCF7如果还没死光, 就继续筛(大概2-4周) 06/13 01:55
39F：→ blence: 其实没必要探讨supercoil与test condition,stable不讲求这 06/13 10:48
40F：→ blence: 些,而是integration,所以才有linearized plasmid for 06/13 10:50
41F：→ blence: stable transfection的尝试;transfect再好细胞也是死一堆 06/13 10:55
42F：推 chaunen: transfection效率高integration 也会比较高吧? 06/14 00:17
43F：推 chaunen: 跑胶看supercoil的比例只是要验证这管plasmid的品质, 06/14 01:02
44F：→ chaunen: 排除gDNA,RNA污染外,一般来说supercoil比例应该最高 06/14 01:03
45F：→ chaunen: 比例低则可能已经产生nicked form 并不适合transfection 06/14 01:03
46F：→ chaunen: B大提到的linearized plasmid是会增加integration没错 06/14 01:04
47F：→ chaunen: 但前提是plasmid DNA 品质好的条件下. 06/14 01:04
48F：推 chaunen: 除了plasmid品质外,我想transfection condition也蛮重要 06/14 01:21
49F：→ chaunen: 照原PO的结果来看, 推测transfection效率可能不佳, 06/14 01:21
50F：→ chaunen: 导致细胞一下子就死光,几乎没有细胞撑过transient stage 06/14 01:22
51F：→ chaunen: 更别说integrate到gemone的比例又更少了... 06/14 01:22
52F：→ chaunen: 不过我有点好奇, 原PO该不会加到puromycin了吧... 06/14 01:24
53F：→ chaunen: 以上只是个人看法, 有错还请指教(抖~) 06/14 01:24
54F：推 tynse71864: 是说 送进去的是单纯的vector吗 还是有其他的表现pr 06/14 12:07
55F：推 tynse71864: protein 06/14 12:09
56F：→ tynse71864: 我之前做tf (用puro）最後大概剩一成吧 还是能挑 06/14 12:10
57F：→ shinchenboy: 我确定我是加G418 然後筛选浓度我打错了 是1000ug/ml 06/15 10:22
58F：→ shinchenboy: 然後我送入空的vector或是有insert外来序列的vector 06/15 10:24
59F：→ shinchenboy: 一样在加入G418之後几乎是死光的状态 我觉得有可能是 06/15 10:26
60F：→ shinchenboy: 我transfection的过程就没有成功 plasmid的品质我会 06/15 10:28
61F：→ shinchenboy: 跑胶去测试 谢谢各位大大们的建议 小弟感激万分 06/15 10:29
62F：→ Ice9: 呃，你应该也要有个没transfect的纯细胞当对照吧？ 06/15 21:43
63F：推 tynse71864: 有篇Lonza stable clone的protocol可以参考~ 06/17 20:55
64F：推 ararthur: 1mg/ul可能太强了 还是先titrate浓度再看看吧 而且有些 07/23 16:01
65F：→ ararthur: 时候是transfect完後先多养两天再开始Selection 让他有 07/23 16:02
66F：→ ararthur: 点时间表现resistant gene 否则即使有transfect进去也会 07/23 16:02
67F：→ ararthur: 被你挂掉 至於integrated与否 应该是selection後期的事 07/23 16:03