作者polomi (polomi)
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标题Re: [求救] PCR定序结果 forward跟reverse完全不同
时间Mon Jul 6 11:24:06 2015
不好意思，前两天学校大停电~
整个都呈现无电状态@@
现在才看到大家的回覆~~
→ Ice9: design another forward primer to read through the end… 07/02 17:46
→ roy047: reverse乱黏, 可重新设计或是同一楼 07/03 14:54
其实我一开始是先用定序公司提供的序列，
现在已有在设计一段序列使用，
等待重新定序。
→ xxtomnyxx: Reverse 的定序 AB1 图是单一 peak 但是序列都不对吗？ 07/03 22:09
从revers端去看几乎都是错置的，
贴图一下
http://imgur.com/xMLIa7H,3tmnlfv#1
长度偏短，
且几乎都是错置居多。
而forward端
则是
http://imgur.com/xMLIa7H,3tmnlfv
长度为1050 bp，
除了前後端外，
几乎都是单一paek，
而且符合我的预期结果。
→ blence: 看起来insert超过1k？ 07/04 00:26
送入片段为 1092bp
→ supray: 可能你的reverse primer有多个binding site吧? insert中有 07/04 23:46
→ supray: 相似序列? 07/04 23:46
应该是不会
1. M13F (-40) 5'-CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3'
2. M13R(-48) 5'-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG-3'
3. M13F(-20) 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
4. M13R(-24) 5'-AAC AGC TAT GAC CAT G-3'
有比对过，
专一性都算满高的~
→ supray: 同一楼 从已定出的序列设计新primer 07/04 23:49
恩恩，
希望这次的定序会准一些 QAQ
上次超神挑的，
1/5的机率也能让我挑到错误的位置，
回来比对整个傻眼了。
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1F：→ Ice9: 你两张图都一样啊～ 如果reverse的图就是那样，那是肯定没有 07/06 14:32
2F：→ Ice9: 问题的。要不要拿去 blast genome bank 看是什麽东西？ 07/06 14:33
3F：→ Ice9: 还有，如果所有条件都非常好，其讯是有可能读到1K以上正确讯 07/06 14:33
4F：→ Ice9: 号的。我以前曾到到过少少的两、三次。虽然讯号很弱，但都不 07/06 14:34
5F：→ Ice9: 会互相干扰。 (我是指1K附近的讯号很弱) 07/06 14:35
7F：→ Ice9: 看来不是 primer 就是 plasmid 有问题啊。讯号很多…… 07/07 17:59
8F：推 satasumi: revers的primer应该污染了 05/13 00:29