作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
标题[求救] RIPA buffer
时间Sun Jul 12 22:55:38 2015
虽然这问题感觉笨笨的但还是问一下好了
在stable clone里面
我的overexpress的 protein与lipid有interaction (有点像lipoprotein
最以前是用TX-100 bfr 但效果蛮差的
原本以为是stable clone没建立好
後来用RIPA lysis後 western表现量有明显的上升
但有个问题
我每次6 well 必须用500ul的lysis bfr表现量才会上升
(之前都用 100~150ul,lysis出来表现量只比TX100高一点)
而用500ul去lysis 每次loading都要下80ul左右 而且细胞还要长很满
我在想是因为150ul太少了吗? 还是因为我的RIPA detergent浓度太低?
目前有想到把SDS浓度提高至1%
(看BCA kit说明书写 如果是lipoprotein可用2%SDS之类的)
但怕会有意外 所以就上来问了
希望做过类似protein或有经验的各位可以帮帮忙
谢谢~
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目前RIPA 配方:
20mM TRIS pH7.5
150mM NaCl
1mM EDTA
1% NP40
0.5% DOC
0.1% SDS
&protease inhibitor (Apr/Leu/PMSF)
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1F：推 michealking: 可以参考abcam的ripa说明，非常详细 07/13 00:34
我就是参考abcam的耶 看来还要念熟
2F：推 bu105330: 都用sigma RIPA R0278 抽protein都很多 07/13 01:59
我们家习惯全部bfr都自己泡 呜
3F：→ Ice9: 如果嫌protein loading 体积太大，可以将要跑的量另存一管後 07/13 07:50
4F：→ Ice9: 在煮蛋白那一步，用不太高的温度打开盖子加热一阵以减少体积 07/13 07:51
5F：→ Ice9: 或是用vacuum dryer减少体积……不过，这样蛋白不会太多吗？ 07/13 07:56
6F：→ Ice9: 另外，可有考虑用digitonin取代Triton？ 07/13 07:57
digi不是比tx100更弱的detergent吗?(印象中) 虽然我看蛮多人做IF会用
家里也还要找找
7F：→ blence: 如果protein load需要用到80ul,应该换Ab或用IP比较好 07/13 09:17
8F：→ blence: 6well用150ul应该会够,还是你用on-dish lysis被稀释掉了? 07/13 09:21
9F：→ blence: 要是量的问题没解决,别先BCA了,直接sample buffer lysis试 07/13 09:24
Ab应该不太能换 因为是自己lab打兔子来的 (很久以前就在用了
我的80ul大概是80ug (测浓度後加smp bfr的总体积)
主要是我们家不是跑小胶 是大胶 只load 50ug讯号不够强
我是on-dish lysis 没错,但我加lysis bfr前会把plate斜放,把多的PBS吸掉
最後体积跟我加入的bfr是差不多的，稀释应该不是主因
smp bfr直接lysis我是有听过,但是不是DNA会全部跑出来 (?)
这样还能另外加protease inhibtor吗
10F：→ blence: 我不认为on-dish lysis可以把PBS吸多乾净,拿空盘试就知道 07/13 18:53
11F：→ blence: 用150 lysis可以回收150,用tube都不见得这麽准,正暗示有多 07/13 18:56
12F：→ blence: 的PBS在维持湿润阿,这样150小体积lyse效果不好是必然的 07/13 18:59
13F：→ blence: 提到换Ab是你用oe蛋白讯号却很差,或许有tag Ab可试 07/13 19:03
14F：→ blence: 若非同细胞在一般transient下操作很正常,你遇到的是系统性 07/13 19:09
15F：→ blence: 问题,纯粹是侦测难度高於一般,跟stable clone无关 07/13 19:12
这样应该先用PBS刮下来後 再用bfr lysis吗
但刮的动作应该也会让蛮多细胞破裂的(?)
还是就真的直接用sample buffer (这样要怎麽定量阿~~
其实也蛮好奇为什麽不用tag的
可能觉得加tag对protein function有影响吧 还要再测试 (我的15kda)
因为现在用的Ab是polyclonal 我的background永远比讯号强= =
但老板说没差就是了
是说斜放的方法好像是b大发文中 下面推文的建议
※ 编辑: tynse71864 (118.168.116.46), 07/14/2015 05:49:54
16F：推 gps0110: on dish lysis 我觉得没稀释很多 不过我比较喜欢用urea/s 07/14 17:33
17F：→ gps0110: ds当lysis buffer 07/14 17:33
18F：→ blence: 有没有稀释很多自行拿空的dish测试lysis buffer便知 07/14 18:25
19F：→ blence: 原po遇到"150ul不行,500ul才能lyse",如果浓度没变怎会如此 07/14 18:27
20F：→ tynse71864: 稀释测试是+5～10ul左右 07/20 15:30