作者shinchenboy (欣承男孩)
看板Biotech
标题RNA stability 测试
时间Thu Jul 30 11:59:07 2015
各位大大们好
最近小弟的实验开始做到mRNA stability的测试
主要的实验策略就是将Actinomycin D加入MCF7细胞中抑制mRNA生成
然後受各个时间点的RNA来做qPCR
来观察RNA降解的情形
小弟有几点细节不太了解所以想来厘清下
1.是细胞刚Seeding完就可以加入Actinomycin D，还是要等细胞都贴附
，隔天在加药???
2.加入Actinomycin D之後大概是要等多久开始收RNA呢???
3.在小弟以往的实验中在上qRT-PCR之前是一定要把所有RNA sample的浓度和量
调成一致，跑完qPT-PCR之後也会把每个RNA的Ct去对GAPDH mRNA的Ct去做校正，
目的就是为了让每个RNA sample是在相同的量下作为基准才能真正比较出在不同
condition下RNA表现量的差异，那这样的话在RNA stability的实验中，每个时间
点的total RNA的表现量理论上来说应该是会随着时间的增加而减少才对，所以
这样的话把每个时间点的RNA收下来之後要把大家的量调成一致在上qRT-PCR吗???
跑完之後来要对GAPDH进行校正吗???
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1F：推 chaunen: 一般看到都是: 1.隔天 or 50% or 90% 开始加药 2.最多24h 07/30 12:23
2F：→ chaunen: 内, 5ug/ml 3. 我觉得你对 有错楼下请指正 3Q~ 07/30 12:24
3F：推 mesenchymal: 2.大部份都24h内 3.可以试着用2-3种HF相对长的genes 07/30 12:36
4F：→ mesenchymal: 当internal controls, 如(18s rRNA, beta actin...) 07/30 12:37
5F：推 mesenchymal: GAPDH也有人用,但你可以先测试找出最适合的 07/30 12:41
6F：→ Ice9: 建议还可以参考文献中和你使用同一种细胞的人，在 mRNA sta- 07/30 13:40
7F：→ Ice9: bility 实验中的实验条件做比对。 07/30 13:40
8F：→ Ice9: 另外就是，只考虑 Act-D 吗？ DRB 和 alpha-amanitin 呢？ 07/30 13:47
9F：→ Ice9: 如果我记得没错，有些实验连 translation inhibitor 都会加 07/30 13:48
10F：→ Ice9: 当然，这都要看你的实验需求。 07/30 13:48
11F：推 Ianthegood: D很好用是它便宜而且specificity很高 可以用pol I 07/31 09:49
12F：→ Ianthegood: 或 III 当control.或是取固定量细胞做绝对定量 07/31 09:50
13F：推 ararthur: ActD蛮普遍 应该先试试它没错 08/03 00:44
14F：→ ararthur: 问题3其实是在一个假设下：你的treatment对於细胞可能造 08/03 00:45
15F：→ ararthur: 成部分 (但不是大部分)的RNA stability改变 所以你依旧 08/03 00:46
16F：→ ararthur: 可以先在RT前用同样的RNA amount去做 qPCR也用相同体积 08/03 00:46
17F：→ ararthur: 的cDNA去amplify 08/03 00:47
18F：→ ararthur: 所以比较可信的并非是ActD-treated mRNA half-life time 08/03 00:48
19F：→ ararthur: 而是在各个时间点 treatment组与control组的ratio 08/03 00:49