作者blence ( )
看板Biotech
标题Re: [求救] TA cloning相关问题
时间Sun Aug 2 02:23:49 2015
既然提到colony PCR (cPCR)的需求
我也回应我的观点
问题起源与关於cPCR的使用时机与功能
假使24,48甚至2x48都可以作为cPCR的组数
那不知道这个的limitation在哪里？
抑或熟手cPCR在3,4,或6组就足以挑到或几乎都是candidate
那何不直接mini还多进行cPCR筛选？
我对传统RE-mediated cloning有以下两种分类
必要步骤包括：准备insert,准备vector, ligation, transformation, mini-prep
协助步骤包括：insert/vector cleanup, ligation-check
colony PCR, gel&sequence check
cPCR非核心步骤,又有gel check与定序替代
所以我是这麽看cPCR的
当只有一开始完全没人带没人问的时候，才有cPCR的妥协
但如果以xxtomnyxx板友熟悉操作,若cPCR能剔除的也才一两颗，何不直上mini就好？
因此我自认为cPCR可省略的理由至少有：
1.无法对mini-prep预先剔除做出贡献
2.对太大的insert,不容易以两端seq primer操作
3.台制每个mini-prep约8~20元，用cPCR看不出能省经费
4.我个人有同事协助,每少一个步骤就给对方少一个操作麻烦
以下是我以及我的助理同事的流程
template来源约7成自cDNA(<3kb), 2成购买clone(>3kb),约1成是gDNA
Day 1, PCR amplify (25ul),全部拿去gel extraction
pJET blunt-end ligation, transform
Day 2, 早上pick up colony(3~4颗)，下午mimi-prep
五点前定序(其中2~3颗)
Day 3, 下午比对定序, RE cut, insert extraction或cleanup
Day 4, ligation, transform
Day 5, pickup colony(3颗), mini-prep, gel check
若只是换vector
Day 1, RE,gel extraction/cleanup, ligation, transform
Day 2, pick up colony, mini-prep, RE cut, gel check, medi 放大
Day 3~5,可以从medi-prep,transfection做到收cell lysate
除了少数size太大,或序列本身不稳定
只要星期一从cDNA的25ul PCR有微弱band，基本上下周二都可以预期做transfection
test (而且周末不用加班)
如果讯号够强,也会跳过cloning vector直接送进expression vector，
这样五天就有medi scale plasmid
通常有不顺利都是是手上的cDNA无法在PCR放大
回到原po的问题，显然是对自己使用产品的不熟悉
所以我才建议应该从protocol着手(以及其中的troubleshooting)
或者至少先向熟悉的前辈求救，而不是继续用cPCR在白点中捞针
以下例子是我对我们lab用的产品的了解，
根据KOD或advantageII，可以决定要送2-6管去定序比较保险
从pJET效率，只要是colony不用跑胶就知道必有insert可以去定序
切Fastdigest，知道多久或要不要CIP可以挑不到self-ligate
用不同ECOS品系，可以知道长不出来跟transform无关
gel extraction/cleanup,elute体积不该是越少越好，TM会有说明
普通的I:V ligation，一般的10X ligase(NEB)就很方便，不必要2X
而且vector每次用10ng以足够，一开始切0.5~1ug以内就好
如果该RE-cut vector没self-ligation，冰-20可以放5年以上还可用
上述column kit除了gel extraction，其他也都用台厂
最後附带一提，以下观点也跟xxtomnyxx相反
对於暑期生或rotation
基於技术学习，我反而会介绍cPCR并且给予练习与尝试机会
但如果是要常驻硕、博班学生
除非是自认为一定要挑一二十管而且用cPCR才是叫cloning这种自认很熟的新人外
我自己带就一定跳过完全不考虑去提cPCR
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以上提到的商品试剂皆由实验室经费自行购买
文章内经验分享无厂商以任何形式的赞助
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怎样算是序列不稳定？ (复选)
A) Donator提到该cDNA plasmid在37度长的100%都错的，
要30度而且要48h才会有正确的
B) 有一颗,mini菌液在37度长到6～8h些微变浊(mini-prep, size不对)，
至16h完全澄清
C) 又有颗,mini菌液在37度8~10h有变浊(此时mini是对的)，放超过20h变更浊，
但plasmid会不见
D) 37度plate放16h，正常大的colony都是错，要挑比satellite小的colony才是对的
E) RE-based insert，接进plasmid後挑去定序，每颗都有突变(indel, point m)
都在不同位置
※ 编辑: blence (114.33.221.4), 08/02/2015 02:24:17
1F：推 xxtomnyxx: 因为我最近就有两个 clone 直上 mini,结果是错的，回头 08/02 03:21
2F：→ xxtomnyxx: 做 cPCR发现没有一颗菌落是对的...... 08/02 03:21
3F：推 xxtomnyxx: 虽然我只挑了 7 颗但我知道其他的要挑到应该没什麽机会 08/02 03:22
4F：→ xxtomnyxx: 。 08/02 03:22
5F：推 xxtomnyxx: 然後其实你 day 2 时养 mini 也要等，如果没其他实验要 08/02 03:32
6F：→ xxtomnyxx: 做还是可以做个 2 in 1，这样可以更确定可以拿到对的 p 08/02 03:32
7F：→ xxtomnyxx: lasmid，就挑个3、4颗然後拿 cPCR 有讯号的抽 mini，可 08/02 03:32
8F：→ xxtomnyxx: 以避免失败而花更多时间或浪费 mini column。 08/02 03:32
9F：→ blence: 因为成功率高,PCR就多余了,除了用时间做其他事,也不想助理 08/02 04:09
10F：→ blence: 太麻烦,上面也说了,mini可能比PCR便宜喔;另外上面也有提 08/02 04:12
11F：→ blence: 我们常只抽mini不切RE甚至不跑胶直接送定序,就是对colony 08/02 04:16
12F：→ blence: 有信心,我们只怕cDNA没band,只要有,很难mini会失败 08/02 04:21
13F：→ a90648: pJET成功率真的很高，如果是用它的话我也是直接送定序 08/02 12:44
14F：→ Ice9: 在我们 Lab，colony PCR 并不是提高成功率的手段，是用来批 08/02 13:42
15F：→ Ice9: 量 construct 一堆东西时，省时间的方式。Colony PCR 在我们 08/02 13:43
16F：→ Ice9: 来看，真的对经费不友善；除非有些用到的方式比它还贵，例如 08/02 13:45
17F：→ Ice9: 稀有RE之类的。而且，在我们Lab，硕士生的方法训练比出不出 08/02 13:46
18F：→ Ice9: 成果还重要。常规手段做不出来时，得找出问题和解决之道，当 08/02 13:47
19F：→ Ice9: 然能出成果是最好，毕竟这也影响毕业速度——当然，在文章 08/02 13:49
20F：→ Ice9: revise 期间，一切都以 Publication 为重……Orz 08/02 13:50
21F：推 tchan: cPCR主要是省时间但是耗费较昂贵的技术，看各人怎麽选择 08/03 01:15
22F：推 chaunen: 请教一下 大大们是用哪种酵素来做cPCR? 我P一个clone 1块 08/03 14:44
23F：→ chaunen: 我只是用普通的2X mix 产物2.5k内 band都很强阿... 08/03 14:45