作者myelroy (阿炮)
看板Biotech
标题[求救] 斑马鱼成鱼脏器RNA萃取
时间Mon Aug 3 15:27:46 2015
请问各位RNA神人们QQ
我近来需要萃取斑马鱼成鱼胰脏进行Q-PCR的基因表现量定量实验
所以理论上RNA的品质不可以太糟
而我们实验室之前都只有在萃取斑马鱼胚胎的total RNA，而我已经有爬过文，
并且问过估狗大神怎麽抽斑马鱼的胰脏RNA了，可是没有找到适合的方法
目前我使用的方法是:
(取sample)
1.把成鱼用低温使其冻晕/死
2.利用水震荡过的镊子以及剪刀将成鱼从泄殖腔往前往上剪开
3.把鱼皮剥掉後去除卵巢/精囊
4.把肠道上覆盖的肝脏去除
5.把肠系膜剥除(斑马鱼胰脏分布位置)
(RNA萃取)
1.把取出的样品加入600ul Trizol用研磨棒磨碎
2.用24G的针头来回抽取数次确认样品非常的碎
3.再加入600ul Trizol
4.加入250ul chloroform
5.用votex的方法震荡到混和液是草莓牛奶的颜色
6.离心13500rpm,30min,4度C
7.抽取上清液到新的1.5cc tube
8.加入上清液一半体积的酸phenol，轻微摇晃混合静置5min
9.加入和phenol等体积的chloroform混和均匀
10.离心13500rpm,30min,4度C (重复step7-10一次)
11.抽取上清液
12.加入1/2体积的salt(1.2M sodium Chloride, 0.8M Sodium Citrate)
和1/2体积的2-propanol
13.-20度C沉降20分钟
14.离心13500rpm,20min,4度C
15.75%DEPC-EtOH wash pellet
16.抽风柜中air dry
17.40ul DEPC-DDW回溶(60度C)
(结果)
con.(ng/ul) 260/280
pancreas RNA 1861 2.1
4dpf embryo 1369 2.1
RNA胶图
http://imgur.com/ZjUJMwK
以上谢谢大家
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1F：→ a90648: 为什麽要做8~11的步骤阿? 08/03 15:33
2F：推 chaunen: 对阿 不是上清液加等量isopropanol然後离心沉淀RNA吗@@? 08/03 15:40
3F：→ myelroy: 不做做8-11吗? 因为Trizol/chrolform完介面层还是会有白 08/03 15:52
4F：→ myelroy: 白的东西 那些不是DNA污染吗?所以我们实验室都会再用 08/03 15:53
5F：→ myelroy: 酸phenol过个一两次，确定没由白色丝状物 08/03 15:54
6F：→ a90648: 那个白色不是污染而是本来就会有的东西 08/03 15:55
8F：推 chaunen: 那个不就主要是变性的protein吗?还帮你隔开上下层 超贴心 08/03 16:05
9F：→ myelroy: 虾咪!!谢谢各位的指正 那请问我取样品的方式有错吗?? 08/03 16:10
10F：推 chaunen: 我有点好奇24G针头来回抽吸gDNA会不会断? 请楼下大大解惑 08/03 17:07
11F：→ a90648: 断了应该也没差啦!! XD 有没有错主要看你上清取多少罗 08/03 17:10
12F：推 chaunen: 更正一下, 由於trizol是酸性,使得DNA会沉淀於interphase 08/03 17:56
13F：→ chaunen: (离心後), 所以白色那层应该是protein/gDNA. 08/03 17:58
14F：→ Ice9: 多余的步骤可以去掉。另外，步骤3/4之间和5/6之间，我家习惯 08/03 18:21
15F：→ Ice9: 放置一段时间，大约是5mins @ RT。在弄乾时，RNA 不要全乾， 08/03 18:22
16F：→ Ice9: 否则很不好回溶。对了，你 phenol 有另外调 pH 值吗？ 08/03 18:23
17F：→ Ice9: 还有，你的步骤12和一般用法不同，有什麽依据吗？ 08/03 18:34
18F：→ myelroy: 回I大我没有另外调整phenol的PH值耶~我们都直接买PH4.5 08/04 00:00
19F：→ myelroy: 回a大我的上清液大概都会取500ul 08/04 00:02
20F：→ myelroy: 步骤12会用salt其实我不确定真正的原因，可是我去查有说 08/04 00:03
21F：→ myelroy: 法是盐类可以帮助RNA析出，而且在萃取胚胎的RNA用我们的 08/04 00:05
22F：→ myelroy: protocol可以在室温完成全部的步骤 08/04 00:05
23F：→ blence: 我猜问步骤12不是要问用salt的原因,而是配方的依据何来? 08/04 00:18
24F：→ a90648: 用Trizol本来就可以在室温操作啦!!XD 08/04 09:39
25F：→ a90648: 因为你的步骤加了很多Trizol protocol里没有的步骤 08/04 09:40
26F：→ a90648: 我也很好奇这些步骤的来源是什麽，会问你上清取多少 08/04 09:41
27F：→ a90648: 主要就是要避免取到白色那层，取500ul很安全啦!! 08/04 09:42
28F：→ myelroy: to a大 其实那是我老板之前modify出来的protocol 我今天 08/04 22:33
29F：→ myelroy: 有分别用两个方法抽了斑马鱼的胰脏 并跑了RNA胶 如付图 08/04 22:33
31F：→ myelroy: 第一二条是我们实验室的 第三条是trizol method 我现在很 08/04 22:34
32F：→ myelroy: 疑惑为什麽28s那麽暗 是因为dye吗？ 08/04 22:34
33F：→ Ice9: 我查了一下，你们的方法似乎是从1987年Chomczynske & Sacchi 08/07 04:44
34F：→ Ice9: modified来的，网路上也一堆类似的方法。28S RNA 是被Xylene 08/07 04:51
35F：→ Ice9: Cyanol 遮住没错。下次可以减少dye的配量，或是改变 gel 的 08/07 04:52
36F：→ Ice9: percentage。 08/07 04:54
37F：推 michealking: 斑马鱼脏器够小 直接塞trio 然後照步骤做就好 08/27 07:43