作者grassshan (纸飞机啊欧欧踢欸死)
看板Biotech
标题[求救] western 转渍效果差?
时间Wed Aug 5 14:40:29 2015
细胞种类:分化9天完成的3T3-L1细胞
Protein Loading 量: 100ug
抗体: C/EBP alpha、PPARgamma (Stant Cruz.)
我最近在测试抗体比例，先抓了100ug的最大Protein量去测试
但低到1:200的比例出来都是白片，
重新Hy actin 却是有东西的(但Band没有很粗)
我後续有查胶染coomasin blue
membrane 染Ponceau S
结果如下:
http://imgur.com/fTjXYbb,wC4sj4c#1
http://imgur.com/fTjXYbb,wC4sj4c#0
之前因为转渍效果不好，
(之前使用200mA 2hr 埋冰放在4度C冰箱中)
有跟老师讨论改在中间放个磁石,
然後包埋冰的情况下 室温 200mA 2hr
但这结果看来，是不是依旧转渍效果差呢?...
我有试着将电压上调到300mA
但我们家电压器好像上不去,一直显示Error
我加了半个小时的转渍时间,但还是不是很妙．．．
想请问各位大大～
还有什麽改善的方法呢？
此外,ECL 我们家使用的牌子是Thrmo的
看protocol 显影时间3min
但我照完一次冷光,想桥位置直接重新照的时候,就又是一片白了@_@
(过程大概5分钟内)
这样要照是再用ECL反应一次吗?
我有听说反应太久会烧片 还是白片？
但我现在宁愿烧片也不想要再看白片了..
然後有需要补充的地方，欢迎大大指教>_<
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1F：→ grassshan: C/EBP alpha分子量37.5 PPARgamma分子量52 08/05 14:45
2F：→ felix0330: 下次加跑 marker，看起来不像 100ug protein 的量，可 08/05 16:25
3F：→ felix0330: 能蛋白质定量有问题 08/05 16:27
4F：→ grassshan: 是多跑几条marker的意思吗@_@? 08/05 20:07
5F：推 tynse71864: 转渍看起来蛮正常的耶 我家也4度转 08/05 20:31
6F：→ tynse71864: 可能是lysate处理的问题 （？ 08/05 20:32
7F：推 lyu0001: 1A 1hr 08/06 08:02
8F：→ alex53001: transfer buffer要不要交叉试试看(换别家or重配） memb 08/27 02:58
9F：→ alex53001: rane是什麽? 是不是PVDF然後没泡MeOH 依我的经验 200mA 08/27 02:58
10F：→ alex53001: ,2hr对於你这个分子量很ok 08/27 02:58