作者flyinrainday (小辫子)
看板Biotech
标题[求救] 有关primary RPE cell培养问题想请教
时间Fri Aug 7 18:35:20 2015
各位前辈您们好，上PTT很久了但因为不熟悉一些指令操作所以不常发言，格式上如果有
错误还请见谅！
回到我的问题，今年接到一个实验是要将仓鼠的RPE细胞分离出来做primary cell
culture，之後要做一些treatment再看几个蛋白质表现状况还有RNA量。
经过一两个月我已经可以分离培养RPE primary cell并完成蛋白质WB部分，当时有将分出
来的约三~四代的细胞放大冻管，因为手边有其他工作暂时停下了一两个月，当我重新开
始实验，解冻细胞开始养两三天，我发现它生长速度变慢，而且随时间细胞跟细胞间的界
线开始变的不明显，一些较分散的细胞开始扩张变得很大颗然後停止生长，感觉就是贴得
非常平，这些细胞用TE打下来继代还是会再贴，但型态就都是跟刚刚说的一样，还有一点
就是TE较难打下来，打下来的细胞大小不均匀形状也不一。这根本没办法做实验。
邪门的是，我用同样方法再取RPE cell重新做primary cell culture，由组织发散出来的
细胞都很漂亮，生长旺盛，但当我用TE切下来做继代之後两三天，型态又开始改变，重复
做了几次都一样。
我先大致说一下我的方法：
1. 分离HM RPE layer
2. 2 u/ml dispase处理10 min, 37度
3. TE处理10 min, 37度
4. 以20% FCS的DMEM/F12停止，1200 rpm spindown後以20% FCS, 1% A.A.以及50 ug/ml
gentamycin的DMEM/F12培养，组织上方我还会盖一片盖玻片帮助贴附。
正常来说，每两天换一次medium，换到第三次再过两天，6cm dish会长大概六成，这时我
会做第一次继代，换成10cm dish，并把组织与玻片给去掉避免影响细胞生长，之後换成
10% FCS, 1% A.A.的DMEM/F12继续放大到第三代就够我做实验。
但当我重新开始做这个实验之後往往在第一次继代之後细胞型态就变了，屡试不爽，一只
只小仓鼠一次次失败，总觉得很对不起牠们压力很大。
想请各位前辈检视一下我过程有没有遗漏或不恰当的地方，我後来有修改几种实验方式：
1. 改用全F12 medium
2. dispase改处理90分钟，不使用TE(这是根据paper的方法)
3. 减半抗生素A.A.与gentamycin用量
4. FCS改用inactive过的
以上全部无效，拜托各位前辈，我身後已经跟了一堆透明小白球了...
感激不尽！
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1F：推 lail: primary cell好像都有这种问题，我是做mouse ADSC，现在就是 08/08 10:42
2F：→ lail: 不冻细胞，细胞一分好养好就全部做实验 08/08 10:42
3F：推 ed791214: 养好全部做实验＋1 RPE的 proliferation能力很差而且 08/09 00:58
4F：→ ed791214: hexagonal morphology要细胞密度很高才会形成 08/09 00:59
5F：推 ed791214: 让细胞慢慢长～长到它的密度够高就应该会有型态了 08/09 01:03
6F：→ flyinrainday: 恩，我新的一批就是6well全养，不用TE切了，结果细 08/10 10:46
7F：→ flyinrainday: 胞数太少，RNA抽出来量不够做QPCR = =" 08/10 10:47
8F：推 melanoma: 细胞型态变化听起来像被污染了 08/20 20:11