作者lxz (梦与天空交织的瞬间)
看板Biotech
标题[讨论] Stripping对磷酸化蛋白的影响？
时间Fri Aug 14 18:43:05 2015
各位先进好
小弟最近在跑磷酸化蛋白的western blot
前天照出来的结果因为不是很好看，所以将membrane strip之後重新染一抗跟二抗
(stripping buffer是thermo的，我室温strip 10~15分钟之後，用1x TBST wash三次)
但重新染得这次用来配抗体的buffer不一样，一抗浓度我也稍微提高了一些
(我用某公司提供的signal enhance buffer的sample来配一抗)
(一抗从1:1000提高到1:700)
结果如下
Stripping前（框出来的是我的target band）
http://imgur.com/T7aNvzR
Stripping後
http://imgur.com/BZ1xMOg
结果很诡异的是，Lane2浓度增强，Lane3浓度减弱
虽然这才是我要的结果，但stripping之後有这样的改变我是第一次遇到
不知道版上的先进是否有什麽建议或看法呢？
变因有三个 1.buffer 2.抗体浓度 3.Stripping
我也会再跑一次试试看，用相同浓度相同buffer去看看是否会有一样的结果
谢谢
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1F：推 tynse71864: 我之前strip过 东西就全没了 ˊ_>ˋ 08/14 20:02
会不会是strip太久@@?
2F：→ blence: 你重染同一支抗体还需要strip吗？ 08/14 20:38
因为我怕二抗影响新的一抗，所以习惯上会Strip之後再染一次，所以可以不用strip吗?
3F：推 moon0126: stripping的时候buffer加不够，摇晃不均匀？ 08/14 22:22
我比较怕我用太多XD
※ 编辑: lxz (111.250.106.64), 08/14/2015 22:26:42
4F：推 tz2733: 两次拍摄得背景值差好多...第一次的lane3本身背景也比其他 08/16 01:47
5F：→ tz2733: lane较亮 不知统计扣除背景值後是否有比lane2高.而第二次 08/16 01:47
6F：→ tz2733: 拍摄背景每条lane比较一致 建议还是重作第二次条件再看看 08/16 01:47
7F：→ tz2733: 吧 加油! 08/16 01:47
我用imageJ统计过，第一次的Lane3确实比2高，我会重做第二次的条件，谢谢^^
8F：→ Ice9: 第一次的背景真脏？用什麽blocking的，不会是 milk 吧？ 08/16 07:30
9F：→ Ice9: 另外，如何知道你 strip 乾净了？可有strip後重染前的影像？ 08/16 07:31
10F：→ Ice9: 一般测磷酸化的WB，不太建议重染。stripping 会减低磷酸化蛋 08/16 07:33
11F：→ Ice9: 白的侦测，signal 降很多。 08/16 07:33
我是用5% BSA去blocking，Stripping是根据buffer里说明书建议的时间去做，做过三次
确定有乾净。
Strip後重染前？是指strip後的membrane的影像吗？
我也在想是不是stripping造成磷酸根掉了QQ
※ 编辑: lxz (111.250.106.64), 08/16/2015 12:43:28
12F：推 tynse71864: 我第一句就是说这个啦ˊˋ 08/17 01:16
13F：推 icome: 不是strip造成的 第一次背景太高 不能当作result 08/21 10:26
来update一下
我後来用5% BSA配抗体，抗体用1:750，成功看到我要的结果，还没试过stripping之後
是不是也会看到一样的结果，但看起来应该是抗体浓度的原因。
谢谢大家:-)
※ 编辑: lxz (111.250.99.20), 08/23/2015 08:35:21
14F：推 HaGa5566: 建议先压磷酸化的 08/27 21:15