作者skywings28 (CPU)
看板Biotech
标题[求救] 纯化蛋白
时间Tue Sep 1 01:53:54 2015
目前自己用E.coli产带有His tag的protein
因此会利用Ni+ affinity beads去抓下来
主要步骤为
1. 15ml sample跟beads(50ul)在旋转盘binding O/N
2. 利用column(空的)把beads留住
3. 用10mM 10ml imidazole来wash
4. elute 用250mM 200ul
就结果来看
有八成的蛋白(包含目标蛋白)都在flow through
一成多elute出来
杂质少
但是产率低
想问大家这个流程是否可以有修改的地方
希望能提高回收率
p.s.有人有用过vivaspin吗 想问一下正确用法
按说明书做
用新的管子10ml sample离了"半天"只离掉下来5ml= =
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 118.166.210.112
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1441043637.A.97D.html
1F：推 DrPiGu: vivaspin的样品要进去之前都要过0.45或是0.20滤膜不然会塞 09/01 07:19
2F：→ DrPiGu: Flow through过高我猜是overload 进样量要再调整 09/01 07:20
3F：→ huosheng: 同意楼上, beads的结合量原本就不能预期太多 09/01 09:09
4F：推 rasaze: 先算一下你预估产量跟beads用量吧 09/01 09:19
5F：→ skywings28: 所以有可能是beads量不够罗?还是说减少loading量下手 09/01 11:32
6F：→ kg9101266: 叙述太少 无法帮您 要不要放个data图 标清IN是浓缩几倍 09/01 19:06
7F：→ kg9101266: loading量占样本的几% 顺便看一下诱导前後的图 09/01 19:07
8F：→ kg9101266: 题外话 我们用Talon Bead效率非常好 好到只要换tag就 09/01 19:07
9F：→ kg9101266: 想哭 因为其他tag的纯化系统跟Talon比差太多 09/01 19:08
10F：推 abcam: vivaspin不好用啊～～ 09/01 21:04
11F：推 skyken10: 请问是用哪个品牌的Ni beads? 09/01 23:55
12F：→ skywings28: sigma的 09/02 01:09
附上部分data
http://imgur.com/9PON5JO
由左至右 依序是 induction前、後、加beads前、blank、flow through、wash、elute
菌液是养250ml 很明显elute只有一点点
※ 编辑: skywings28 (118.166.208.52), 09/02/2015 01:30:34
13F：推 gps0110: 用maker estimate一下你蛋白的表达量 厂商应该有beads bi 09/02 03:02
14F：→ gps0110: nding capacity的资讯 09/02 03:02
15F：→ gps0110: 如果你的beads不是像前面几位版友说的量不够 09/02 03:04
16F：→ gps0110: 忘了问 你的lysate (binding buffer)有没有含imidazole? 09/02 03:04
17F：推 gps0110: 不过感觉起来蛮像是前面版友说的你beads不够 09/02 03:07
18F：→ skyken10: 我曾经有跟你ㄧ模一样的情况，也是用sigma的beads，後 09/02 08:00
19F：→ skyken10: 来把flow through再加入GE的beads，再纯化ㄧ次，问题就 09/02 08:00
20F：→ skyken10: 解决，证明不是蛋白质与纯化步骤的问题，完全是sigma be 09/02 08:00
21F：→ skyken10: ads的affinity很差，根本与说明书上写的差很多，小小经 09/02 08:00
22F：→ skyken10: 验与您分享！ 09/02 08:00
23F：推 kg9101266: 看起来几乎不抓 在binding上就有问题了 你有确认过诱导 09/02 13:52
24F：→ kg9101266: 後的蛋白是在sup吗? 另外可能要请你去查一下bead抓蛋白 09/02 13:54
25F：→ kg9101266: 的量 因为没有标注到底每个lane是loading原样本的多少 09/02 13:54
26F：→ kg9101266: 比如说 我IN有1900uL loading 5uL 就是5/1900 09/02 13:55
27F：→ kg9101266: 去估算这个东西可以帮助你追踪蛋白跑哪去 不过初步看 09/02 13:56
28F：→ kg9101266: 会不会是珠子加太少? 09/02 13:58
29F：→ skywings28: flowthrough部分 我是in 10~15ml loading 12uL 09/02 14:59
30F：→ skywings28: 珠子capacity为 15mg/ml gel 上面有人说实际上更低 09/02 15:01
31F：→ skywings28: IN 指的是flowthrough整个的体积 还是煮蛋白的量? 09/02 15:03
32F：→ skywings28: 煮蛋白我是40ulsample +10uldye 09/02 15:03
33F：→ Ice9: 那elute过後，煮beads的data有吗？另外，你induced前後看来 09/02 17:14
34F：→ Ice9: 差异似乎不大啊。Induction条件要再调？ 09/02 17:15
35F：→ Ice9: 还有，我不觉得杂质少啊。你把图用photoshop调成和诱发前一 09/02 17:18
36F：→ Ice9: 样的画面样子，就可以看到其他bands也跟着出现。 09/02 17:19
38F：→ kg9101266: 如果你只染胶不做WB的话蛋白表现多吗？ 09/03 03:26
39F：→ skywings28: 染胶的话其实主要的band 很弱 flow那个很明显 09/03 12:26
40F：→ kg9101266: 你在南部吗？我觉得这过程叙述很难说清楚，因为你做wb, 09/05 03:21
41F：→ kg9101266: 我不知道你蛋白诱导量多少，也无法知道15ml含多少目标 09/05 03:21
42F：→ kg9101266: 蛋白，破菌和纯化buffer为何，为何要o/n孵育，诱导的蛋 09/05 03:21
43F：→ kg9101266: 白折叠正常吗？做小量纯化测试看看？bead是否有问题， 09/05 03:21
44F：→ kg9101266: 在南部可以约一下讨论，甚至借你一些talon bead用看看 09/05 03:21
45F：→ kg9101266: 。 09/05 03:21