作者swwy1661 (小玉米)
看板Biotech
标题[求救] IHC 冷冻切片 染不出 PCNA
时间Wed Sep 9 14:47:36 2015
各位大大好,小弟是IHC新手 所以目前有遇到问题,希望大大们可以提供意见和协助
实验流程如下
sacrifice 斑马鱼取出brain
↓
4% PFA fix O/N
↓
隔天取出,泡在OCT一小时
↓
OCT包埋
↓
-20度冷冻切片(12um)
↓
将slide,放37°c烘箱，OCT烘乾後取出
↓
PBS wash 10 mins *3
↓
PBST(1% triton X-100) RT 1hr
↓
PBS wash 10 mins *3
↓
blocking RT 1hr (blocking buffer成分 100λ 1X PBS 0.003 BSA 2λgoat serum)
↓
PBS wash 10 mins *3
↓
一抗PCNA 1:50 4°c O/N
↓
PBS wash 10 mins *3
↓
二抗(488) 1:200 RT 2hr (避光)
↓
萤光显微镜
状况:PCNA染不出来,在萤光显微镜下没有显示,之前有上过cofocal也是一样
问题:
1.目前固定斑马鱼脑组织的部分,只有用PFA O/N
没有使用10%~30%蔗糖溶液梯度脱水,是否对於IHC染色有影响?
2.blocking buffer成分部分,看过其他protocol是使用maleic acid
而不是用PBS,不知道是不是因blocking不好,所以导致PCNA染不上?
麻烦各位大大,帮忙一下,看一下实验流程有无错误,或者给晚辈一点建议,谢谢了
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1F：推 michealking: PCNA哪家的？ 09/10 07:08
2F：→ swwy1661: 是Santa Cruz 的 09/10 16:50
3F：推 jabari: ..圣诞老公公的抗体啊... 原po签运不好.. 09/10 17:22
4F：推 johanjohan: 没retrieval 09/10 19:29
5F：→ Ice9: 刚过三伏，未到三九啊，季节不对 XDD 有测试过抗体了吗？ 09/10 22:09
6F：推 michealking: 建议改anaspec 或Genetex 换之前测一下抗体 09/13 00:24
7F：推 kg9101266: Santa的抗体换个lot有时效果就差很多，不过业务都满给 09/17 02:01
8F：→ kg9101266: 换的，试试吧 09/17 02:01
9F：→ bioaspen: 冷冻切片完有先HE染色吗 没使用梯度脱水有时会造成细胞 09/24 12:33
10F：→ bioaspen: 核损而无法染出 建议先试试 09/24 12:34
11F：推 haoen: 有用PFA没retrival…你觉得做得出？ 09/27 19:14