作者hsinhsien (HH)
看板Biotech
标题[求救] PPAR gamma IHC染色方法
时间Mon Oct 5 09:14:16 2015
各位学长姐好
不知道有没有人染过PPAR gamma的IHC(可见光或萤光)
我已试过无数种方法却还是没有成功
让我人生陷入困境
以下为我的可见光染色方法
希望有经验的学长姐能过指点迷津
(若因实验方法不希望被公开，麻烦站内信我)
1.脱蜡(不在赘述)
2.煮片：10mM sodium citrate buffer pH6.0煮65度1小时
我同时也有试过以commercial的硷煮65度1小时
3.冷却20分钟
4.PBST洗3次
5.blocking：1%BSA+1%goat serum 30分钟
我同时也有试过+10%goat serum
6.一抗(1:100)4度冰箱overnight
7.回温30分钟
8.PBST洗5次
9.二抗(1:500)30分钟
10.PBST洗5次
11.DAB呈色5分钟
12.ddH2O终止反应
13.Hematoxylin 2分钟
14.PBS洗
15.烘乾
16.封片
我同时也有试过以trypsin42度煮5分钟，并利用2%Triton打洞10分钟
仍然未见效果
希望能给我一盏明灯
谢谢
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1F：→ pandagod: Retrival buufer (citrate)试试看pH9 10/05 15:03
2F：→ pandagod: 另外在retrival完後我会用三次水洗3次然後再用3%或0.3% 10/05 15:04
3F：→ pandagod: 的双氧水(H2O2)反应10-15分钟，去除peroxidase避免影响 10/05 15:05
4F：→ pandagod: DAB或者呈色剂(氧化还原成色)受到endogenous的peroxidas 10/05 15:06
5F：→ pandagod: e影响 10/05 15:06
6F：推 osla30: 二抗wash完後，ABComplex可以用用看，放大讯号 10/05 15:15
7F：推 abcam: 我不建议ABC方法……放大的 根本是二抗，不是放大一抗 10/05 20:07
8F：→ abcam: 伪阳性机会 很大吧～ 10/05 20:08
9F：→ abcam: 你可以 问问市面上 卖针对IHC二抗厂商的意见～ 10/05 20:09
10F：→ abcam: IHC的trouble shotting 真的要有经验的人 比较帮忙快 10/05 20:10
11F：→ jabari: 有没办法改用冷冻染IFA? 我觉得IHC每批染浓淡不一也很讨厌 10/05 20:13
12F：推 abcam: IHC的染色 绝对有深浅之分的不是 0与1 的两瞪眼 染色 10/05 21:08
13F：→ osla30: 但二抗不就接一抗，话说我自己染alpha-synuclein也失败好 10/05 22:35
14F：→ osla30: 久，dab、萤光各种也都试了>< 10/05 22:35
15F：→ hsinhsien: 3%H2O2也试过了，没有，唉 10/06 10:13
16F：推 pandagod: 一抗决定IHC的品质，若二抗或呈色方式都试过了，可以考 10/06 11:28
17F：→ pandagod: 虑换只抗体，另外要买哪只抗体，多爬爬别人的论文，参 10/06 11:28
18F：→ pandagod: 考一下他们的方法，如果雷同就锁定抗体型号，在爬更多 10/06 11:28
19F：→ pandagod: 文，越多人用买回来可用的机率越高...另外可以找染不出 10/06 11:28
20F：→ pandagod: 来可以包退货的厂商购买抗体 10/06 11:28