作者shinchenboy (欣承男孩)
看板Biotech
标题[求救] colony PCR後细菌长不出来
时间Wed Oct 21 00:34:04 2015
我帮我朋友问的
最近在做cloning
construct(vector+insert约13000bp) 完成後
transform到E coli中 然後於LB agar涂盘
37度培养12h後收菌
发现细菌有长(clone颗粒分明)
挑了其中10颗做colony PCR
方法是先用tip沾 然後再PCR tube内晃个几圈(此时里面已有加酵素)
最後再把tip置入养菌小馆
PCR的结果发现其中有几管有insert进去
我们把有insert进去的clone拿去37度培养12h
结果发现细菌没有长出来
後来我们觉得会不会是细菌量太少
所已换了另一种方式
在挑clone时我们用tip把挑到的clone先点在新的LB agar plate上
把它拿去37度培养12h
同时做colony PCR
我们预计把有成功insert进去的clone再拿去液态LB broth中扩增
结果发现点在新的plate上的clone变好大颗
然後挑了有成功的clone继续於液态LB broth中培养
结果细菌仍然长不出来
我们把LB broth换成TB broth仍然长不出来
我朋友已经做了好多次都长不出来(明明agar上的clone很明显)
想请问版上各位大大有没有遇过类似的情况
感激不尽~
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1F：推 jsi: construct较大的时候可能会发生，insert被踢掉，可改换其他的 10/21 00:46
2F：→ jsi: vector. 10/21 00:46
3F：→ blence: 13k,在37度培养12h的clone在agar plate应该不会很明显吧 10/21 01:30
4F：→ Ice9: 有加抗生素？ 10/21 08:04
5F：→ roy047: 养菌管有摇晃吗？...或者是封太紧没空气？ 10/21 08:55
6F：→ ararthur: 养overnight吧 10/21 11:11
7F：推 aceliang: colony挑到LB broth摇，两小时取一滴滴colony PCR 10/21 13:29
8F：→ aceliang: 同一管隔天应该就可以收割了 是否？ 10/21 13:29
9F：→ patricksky: 养久点 我曾经类似状况有养到两夜之久 10/21 14:30
10F：→ patricksky: 然後 养出的菌和质体还是要反覆测试是否正确 10/21 14:31
11F：→ roy047: 还有想到一个 要确定抗生素浓度正确 10/23 10:07
12F：推 Peetu: 筛选的方法?? 抗生素也有分很多种，抗药机制不同会影响 10/28 00:42
13F：→ Peetu: 培养的时间 10/28 00:43