作者dnye (缺少勇气..)
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标题[求救] 细胞免疫萤光isotype control很明显
时间Thu Nov 5 00:52:04 2015
最近在做细胞免疫萤光,
主要是要染膜上的蛋白质,
一抗是Mouse / IgG2b, kappa
二抗则是rabbit antimouse igG接 Alexa Fluor® 488
因此我的ISOTYPE CONTROL就选择Mouse / IgG2b, kappa,
但是结果出来Isotype control的萤光很明显,尤其是在核的部分,
我的步骤是先做固定,染一抗,
染完一抗再用triton 100作permeabilization,
之後以4%BSA做BLOCKING,接着染二抗约一到两小时,
不知道是为什麽结果出来Isotype control的萤光很明显,尤其是在核的部分,
请各位大大指导一下,
谢谢
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1F：→ tharaohfu: sample是细胞?组织切片? 11/05 01:58
2F：→ tharaohfu: 染膜蛋白也不一定要用到Triton 固定完直接blocking 11/05 02:00
3F：→ dnye: 是细胞,因为最後有用Hoest33258染核,所以才加triton 11/05 02:02
4F：→ tharaohfu: 一抗1hr+二抗0.5hr即可(室温之下) 11/05 02:03
5F：→ lail: 换别种fix solution? 11/05 04:57
6F：→ dnye: 我是用4%的PFA当固定液，可以改什麽当固定液？谢谢 11/05 11:41
7F：→ dnye: 好，我试试二抗放0.5hr 11/05 11:42
8F：→ lail: 其他细胞染这只抗体也会这样吗？（一样是你操作的状况下）； 11/05 12:48
9F：→ lail: 换只二抗如何？ 11/05 12:48
10F：→ lail: fix solution网路上找找就有，如methanol，但似乎不适用於 11/05 12:49
11F：→ lail: 膜蛋白的染色 11/05 12:49
12F：→ dnye: 我只有这只细胞，我试试别只二抗看看 11/05 14:44
13F：推 tharaohfu: PFA固定染萤光易有background 建议换固定buffer 11/05 23:43
14F：→ tharaohfu: -20度C的methanol或是acetone都可以 11/05 23:45
15F：→ dnye: 好,我下次试试看,感谢大家,做完再来跟大家报告结果! 11/06 00:23
16F：推 tynse71864: 我会在1抗前permeablize耶 11/07 00:06
17F：→ tynse71864: 另外IgG可以，但不是最好的ctrl, 核内超强讯号不可避 11/07 00:08
18F：→ tynse71864: ，很难去调整你的laser强度 11/07 00:08
19F：→ tynse71864: 你的膜上蛋白是endogeneous还是外送的呢？ 11/07 00:11
20F：→ tynse71864: 若是後者，可用无外送的细胞当ctrl,其次是用IgG,或只 11/07 00:11
21F：→ tynse71864: 下二抗做对照 11/07 00:11
22F：→ tynse71864: 染核我记得只要fix就可以了吧 11/07 00:12
23F：→ tynse71864: PFA易有background,可在blocking时辅以0.2M的glycine, 11/07 00:15
24F：→ tynse71864: 可避免残留的醛基对後续实验的影响 11/07 00:15
25F：→ tynse71864: 洗的时间拉长也可（我是10min*3次 11/07 00:15
26F：→ lail: 我以前染核蛋白用aceton固定即可 11/09 00:27
27F：→ dnye: 各位大大，我今天加一个单独二抗，结果背景蛮明显，所以二 11/10 19:53
28F：→ dnye: 抗有问题 11/10 19:53
29F：→ Ice9: 所以你的实验组呢，细胞核没讯号吗？ 11/10 22:16
30F：→ dnye: 实验组也是有讯号的，只是只加二抗的背景值就已经很高了 11/10 23:06