作者ararthur ()
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标题[求救] 关於自制ELISA standard浓度过低的问题
时间Thu Nov 12 14:12:59 2015
各位好，
目前接了一个实验是设计一个indirect competition ELISA
手上有的东西:
1. human X full-length recombinant protein (欲测蛋白, 非所使用一抗的immunogen)
2. anti-human X mouse monoclonal antibody
(Primary Ab, immunogen为另一来源的full-length X protein, unknown epitope)
3. anti-mouse IgG1 rabbit antibody (Secondary Ab)
4. Human serum sample
5. Human plasma sample
==
||
ELISA策略是：||-X <-1Ab-2Ab*HRP
|| AG->
先将antigen X coating在ELISA用96-well，blocking，
加入待测物AG 与序列稀释的X (as standards)，
再加入Primary Ab, Secondary Ab, TMB substrate, stop,
Count OD at 450nm by ELISA reader.
如若加入的sample会抢走Primary Ab,
则结合在solid phase的X 就会得到比较少的Primary Ab与後续反应的呈色。
([AG]↑，则 OD↓)
==
实验设计之初，
我titrate primary Ab 与 coating Ag,
得到这个结果
http://0rz.tw/h1S3k (Excel表单，第一个工作表)，
由此表得知coating Ag在250ng/ml时 OD值 Max-min的range最大，
而Primary Ab则在4000x dilution时 OD值 Max-min的range最大，
所以我初步设定coating Ag = 250ng/ml, primary Ab = 4000x dilution.
接着我使用此condition测不同稀释倍数的human serum sample，
虽然测试点位不多，但也能明显看到OD随着浓度上升而下降
http://0rz.tw/h1S3k (第二个工作表)
未稀释的plasma组 (OD=0.29) 与未加sample的blank组 (OD=2.24)
OD值差距可以拉到将近2.0;
然而我如果使用序列稀释的 X recombinant protein当作standards
从浓度 3333ng/ml 两倍序列稀释，
http://0rz.tw/h1S3k (第三个工作表)
即使加入最高浓度standard, OD值仍然有1.62之高，降不太下来，
与没有加的blank组 (OD=2.24) 比较起来只相差0.6不到...
而低浓度standard的组别，也几乎就在2.1上下徘徊，
与blank组也相差无几，等於可测得浓度的sample range相当小，
运用在不同来源的sample时会窒碍难行。
我下一步可能会把standard的最高浓度再上调，
试试看是否能够画出range比较大的curve,
只是相对於其他commercial ELISA kit的standard大多落在 1000pg/ml~100ng/ml,
我所设定的standard浓度已经算是相当高，
再浓下去 我的recombinant protein用量与开销就得突破天际了...
===
基於以上遇到的状况，
有几个问题想请教大家：
1. 除了继续加大standard用量以外，我应该如何调整实验condition,
才能把standard浓度拉低 curve仍能维持呢？
2. 这样的问题是由於standard对coating Ag的竞争性太弱所导致吗？
可是两者我都是使用同一种recombinant protein去作，
对打浓度也达到3333ng/ml vs 250ng/ml了，
怎麽3333ng/ml 抢primary Ab 还是抢不过 250ng/ml的呢？
3. 另外有一种有别於competition ELISA的 inhibition ELISA,
是把protein先与primary antibody incubate之後，
再加入well与coating Ag反应呈色，
但我不大了解这样做的原因，所测的目标是coated protein吗？
以上，谢谢看完繁杂的文章，
有任何看不懂的地方也请告知，我会再作更仔细的说明，
感激。
台湾队十二强加油！
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※ 编辑: ararthur (140.112.121.122), 11/12/2015 14:16:04
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※ 编辑: ararthur (140.112.121.122), 11/12/2015 14:23:34
1F：→ lyu0001: 怎不用direct sandwich ELISA 11/19 11:08
2F：→ ararthur: direct sandwich 应该需要两只primary Ab, 其中一只还要 11/21 11:49
3F：→ ararthur: 是conjugated 而且最好还是得要polyclonal 才能有比较足 11/21 11:51
4F：→ ararthur: 够的epitope可供captured 如果我理解没错应该是这样(?) 11/21 11:52
5F：→ ararthur: 但目前手头上只有一只比较可信任的monoclonal Ab 其他的 11/21 11:52
6F：→ ararthur: polyclonal Ab 作WB时那个专一性差得恐怖 Band杂得夸张 11/21 11:53
※ 编辑: ararthur (36.231.94.7), 11/21/2015 12:00:40
7F：→ ararthur: 所以我比较没有信心使用手头上剩余的抗体... 11/21 12:01
8F：→ ararthur: 目前我找到方法 能够把OD range拉至约1.6 基本上是以我 11/21 12:01
9F：→ ararthur: 内文提到的第三种想法 inhibition ELISA 等成功把ELISA 11/21 12:02
10F：→ ararthur: 建立起来 再上来回文给大家一点参考 11/21 12:02