※ 引述《charlene822 (是喔)》之铭言： : 简单叙述一下我的实验 : 实验室研究的某个A蛋白正常为monomer形式存在 : 但加入了B药物後会随着药物浓度增加渐渐形成dimer : 而我想经由Mass知道他形成dimer是哪些胺基酸的片段或位置影响的 : 就我所知可以利用trypsin来做水解特定胺基酸的处理後再上机分析 : 我想请教的是:我们实验室是用column纯化出来的蛋白 需要跑胶处理还是直接可以用纯化 : 後加药的蛋白来做比较? : 如果是的话蛋白浓度以及怎麽加入trypsin处理 还有trypsin的量要加多少? : 小弟对於这方面一无所知 有劳各位大大救命了 感激不尽 小弟从大二到硕二一直都在蛋白质体实验室做实验， 以下是实验室的经验，给大大参考一下。 再推文里也有提到过，不管是monomer还是dimer，trypsin都会切， 所以一定要用crosslinker进行处理，如DSP等。 但我很怀疑的是打mass真的可以帮你解决你的疑问吗? Crosslinked以後只要有Cys都会形成共价键，也不能让你知道dimer的型成是那些 residue所贡献的。你只能知道经过药物treatment後dimer的量是增加的。 (可以比较treat药前与药後的cross-linked蛋白A的spectra count作相对定量) 要找出那些residues是重要的，只能透过mutagenesis去做。 这是我个人的想法，可惜我才疏学浅，要其他大大帮忙这部分。 在实验方面，蛋白质要先跑胶还是直接做digestion，其实除了取决於sample的复杂性以 外，还要考虑到digestion的efficieny。 现在做digestion最普遍的方法有两种，一种是in-gel，一种是in-solution。 前者的efficieny绝对比後者好，原因不太清楚。询问过蛋白质体中心後， 它们认为原因是peptide在solution中是流动的，这样会降低peptide与trypsin的 碰撞机率。相反，在胶里面的话会相对固定，trypsin就比较有机会进行作用。 所以不管sample来源，推荐用in-gel digestion了。 protein量的部分，取决於你LC-MS/MS所用的analyzer是哪一种，我们家最常使用的是 Thermo LTQ orbitrap XL，号称sub-femtomol都可以监定的到。 但实际上也不会用这麽少，我的经验是SDS-PAGE load 5ug protein都有很好的效果了。 所以简单介绍一下protocol: 1. Load 5ug protein跑SDS-PAGE 2. Coomassive染色，用水退染一下，band不要太深色。 3. 挖出你要监定的band，你可以用tip挖一个圆点做监定，也可以挖出一长条band。 4. 如果是长条band的话就把他切成一小块，大小大概1mm^3，把胶粒放在eppendorf里面 5. 进行退染，100% ACN dehydrate与25mM NH4HCO3 rehydrate，重复直到胶没有蓝色 6. ACN dehydrate後加入1-2 ul的 20 ng/ul trypsin (dissolved in 25mM NH4HCO3) trypsin的量这样是一定足够并多出一些的， 7. 冰上1小时，让乾掉的胶块吸取那1-2 ul的trypsin，这时候胶块会变透明 8. 补上20 ul的25mM NH4HCO3，37度O/N 9. O/N後再补20 ul的NH4HCO3，用sonicater extract peptide 10. 真空抽乾 11. 回溶上机 回溶的部分看你的LC的solution是什麽，我是用12 ul 0.1% formic acid回溶 取10 ul出来放进mass的sample管子里面，机器会取其中的7 ul打mass --

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