作者hachibuya (黄金骑士 牙狼)
看板Biotech
标题[求救] qPCR做不出做不出预期结果?
时间Wed Nov 25 16:37:41 2015
我实验室在测某种药物加到癌细胞後和放射线治疗的关系
药物的厂商有帮我们做DNA的microarray
跑出来後蛋白质fibronectin有很明显如预期的差异
(没加药global normalization为428, 加了药的降到215)
因为只有microarry的data感觉很虚
所以老师说用realtime qPCR跑看看
我们的机器是Roche的LightCycler Nano
一开始是用SYBR GREEN染, 对照组是用18S
结果不同时间养的细胞做出来的结果很不一
(对照组和加药组间的结果很不稳定 有时算出来是对照组高 有时加药组高
但相同sample做duplicate或triplicate是没问题的)
甚至连相同的cDNA sample放了一周後也无法做出一样的结果
後来另一个老师说这可能还是手的问题
建议我用hydrolysis probe 可以同一个sample里染不同的cDNA
照了建议重新设计买了primer和probe
还有universal probelibrary GADPH的primer和probe
结果是可以在同smaple同时做出两种基因的表现
但Cq值的relative 定量计算结果还是乱七八糟的
怎麽做都做不出microarry的结果
上网查了一下好像也没有定论说microarry和qPCR的结果一定会一样或不同
因为我不是生科本行出生的 不知道各为大大怎麽看?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 133.87.71.254
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※ 编辑: hachibuya (133.87.71.254), 11/25/2015 16:38:03
※ 编辑: hachibuya (133.87.71.254), 11/25/2015 16:38:45
1F：推 jabari: DNA microarray?? 11/25 17:07
2F：→ hachibuya: 对 11/25 19:44
3F：→ blence: DNA array有变化为什麽是去看RNA？ 11/25 20:35
4F：推 aggaci: 应该是cDNA array 11/25 20:52
5F：推 lelojack: 一般来说 qPCR是黄金标准 array的结果要做重复 才可能 11/25 21:19
6F：→ lelojack: 不用qPCR验证 11/25 21:19
7F：推 lelojack: 我觉得你应该要相信qPCR三重复的数据 11/25 21:21
8F：推 lelojack: 我以前分析array. 不同的型号array 同样的probe 数据 11/25 21:28
9F：→ lelojack: 据我口委的说法 是不能整合在一起 11/25 21:28
10F：推 lelojack: U133A的数据不能跟U133plus2的数据一起比较 11/25 21:31
11F：推 lelojack: 而论文有提过 array低表达的基因讯号不准 建议你看一下 11/25 21:49
12F：→ lelojack: 整体数据 可能数值两百算低表达的 11/25 21:49
13F：推 michealking: CP数据贴上来看一下，然後你的RNA quality如何 11/25 22:42
14F：→ michealking: 翻的kit 用的浓度都找到一个标准的方法做 11/25 22:43
15F：→ michealking: 然後你以前有做过qPCR吗?没有跟一个做过的一起做一次 11/25 22:44
16F：推 lail: 送array的sample还有吗？拿那个sample来做，看跟array的结果 11/25 22:59
17F：→ lail: 是否相同 11/25 22:59
18F：推 notmyself: 三重覆 是指三个sample 各抽RNA跑 11/26 08:37
19F：→ notmyself: 还是同一个cDNA load 3个well 11/26 08:38
20F：→ hachibuya: 同一cDNA跑三个well 11/26 09:34
21F：推 allisa: qPCR其实满准的又很灵敏，如果你同一管cDNA做的重覆数值 11/26 14:32
22F：→ allisa: 差到0.1 就是你做的不准确 要不要请会做的人带你做一次? 11/26 14:33
23F：→ allisa: 同一管cDNA之後要再跑之前有没有确实vortex and spin down 11/26 14:34