※ 引述《aaa111bb2 (Nate)》之铭言： : Cloning 相关问题 : Vector为10K , RE 相距 9bp, 分别为 SNABI 及 NHEI (Sticky end and blunt end) : NEB, smart buffer 取vector 1ug同时切两刀 o/n DNA浓度跟纯度OK的话,切满个2 hr就很够了, 放久有些酵素还会乱切 : Insert 是chromosome PCR product 约 1.1K, 有major band , 而Primer有各预留 2bp 及 6bp. : 跑完0.8%胶, 後进行clean up : 利用NEB Quick ligation (Molar ratio: 1:7) 10 mins insert两端是blunt end? 是的话接不进去啊... ligation可以作用久一点 : Transformation on ice 20 mins, heat shock 42度 45秒, on ice 5 mins : Add S.O.C medium 500ul and incubation 1h 37度 : 取 200ul 涂盘 能用电穿孔的话, 效率会更高 : 失败…已经试很多次 失败是都没长? 还是长很多vector only? 关系到你後续trouble shooting要往哪 : 没有任何中继站 可以进行Check, vector 切完 也看不出来 我会把insert先接到TA vector上, 至少之後切下来後可确定insert两端是我要的样子 要找出问题的话, 你要在不同阶段多做一些控制组, 不过新手的话, 通常出错点不会只有一个 : Ligation完 10K->11K 也很难看得出来 : 不知道有没有高手使用过这两种RE????或是可以给点建议 因为可能出错的点太多了, 如果你急着要得到这个clone 我的建议是找附近cloning做得很顺的人帮忙, 没必要卡死自己研究 如果你有好好磨练自己技术跟逻辑的时间跟决心, 那就可以一步步找出问题在哪 Good luck --

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