作者licat (licat)
看板Biotech
标题Re: [求救] Cloning
时间Thu Nov 26 00:18:59 2015
※ 引述《aaa111bb2 (Nate)》之铭言:
: Cloning 相关问题
: Vector为10K , RE 相距 9bp, 分别为 SNABI 及 NHEI (Sticky end and blunt end)
: NEB, smart buffer 取vector 1ug同时切两刀 o/n
DNA浓度跟纯度OK的话,切满个2 hr就很够了, 放久有些酵素还会乱切
: Insert 是chromosome PCR product 约 1.1K, 有major band , 而Primer有各预留 2bp 及 6bp.
: 跑完0.8%胶, 後进行clean up
: 利用NEB Quick ligation (Molar ratio: 1:7) 10 mins
insert两端是blunt end? 是的话接不进去啊...
ligation可以作用久一点
: Transformation on ice 20 mins, heat shock 42度 45秒, on ice 5 mins
: Add S.O.C medium 500ul and incubation 1h 37度
: 取 200ul 涂盘
能用电穿孔的话, 效率会更高
: 失败…已经试很多次
失败是都没长? 还是长很多vector only? 关系到你後续trouble shooting要往哪
: 没有任何中继站 可以进行Check, vector 切完 也看不出来
我会把insert先接到TA vector上,
至少之後切下来後可确定insert两端是我要的样子
要找出问题的话, 你要在不同阶段多做一些控制组,
不过新手的话, 通常出错点不会只有一个
: Ligation完 10K->11K 也很难看得出来
: 不知道有没有高手使用过这两种RE????或是可以给点建议
因为可能出错的点太多了, 如果你急着要得到这个clone
我的建议是找附近cloning做得很顺的人帮忙, 没必要卡死自己研究
如果你有好好磨练自己技术跟逻辑的时间跟决心, 那就可以一步步找出问题在哪
Good luck
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