作者yoyukiyo (Green)
看板Biotech
标题[求救] 胶体纯化的回收率低
时间Wed Dec 2 02:06:08 2015
最近在做cloing
要将1k左右的片段接到vector上
目前的做法是切10ug的insert
跑胶分离後切下要的片段进行胶体纯化
然後我是用GeneMark的kit
目前是一直卡在elute後的O.D值都很低
回溶的体积为25-30ul
但是O.D大概都在20-30ng/ul间
虽然这样算一算浓度还有将近1ug
但是後续还要进行blunting
表示前面的浓度要高一点
才可以继续後面的纯化...
想请问大家要怎麽提高kit的回收率呀QQ
厂商都标榜回收率将近90%
怎麽我反而是相反= ='''
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1F：推 puddinggg: 10ug去切是指total 10ug吗？如果vector5k，这样你原始1 12/02 02:53
2F：→ puddinggg: 0ug切出来完全不lost insert也只有2ug而已 12/02 02:53
3F：→ hitmd: 胶体纯化我觉得用kit很看脸，不同品牌在不同实验室都有不一 12/02 07:52
4F：→ hitmd: 样的效率 12/02 07:52
5F：推 patricksky: 量很够了吧? 你总量要下多少做transformation? 12/02 09:53
6F：推 patricksky: 通常vector+insert约1ug 就有clone可以挑了 12/02 10:04
7F：→ yoyukiyo: 是total取10ug去digestion 然後全下跑胶 12/02 11:26
8F：→ yoyukiyo: 我是用学姐的纯化方法 然後同样的kit 学姐就说没纯化这 12/02 11:31
9F：→ yoyukiyo: 麽少= =''' 12/02 11:31
10F：→ yoyukiyo: 因为後续还要用pfu polymerase做blunting 然後再纯化一 12/02 11:36
11F：→ yoyukiyo: 次 所以担心目前的浓度不够(椅稻･`) 12/02 11:36
12F：→ blence: 你没有回答到1楼问的10ul是哪里来,这才是关键 12/02 13:34
13F：→ blence: 10ug 12/02 13:35
14F：→ blence: 既然可以知道10ug,想必来源不是PCR产物,而是plasmid这类 12/02 13:38
15F：→ blence: 既然如此,直接用pfu从plasmid以PCR放大,这会不会更方便? 12/02 13:40
16F：→ untilnow: 一块胶不够,你怎麽不切两块 12/02 17:54
17F：→ Ice9: 要是你的原始plasmid是9K以上，那切下来是那个量很正常啊。 12/02 18:10
18F：→ Ice9: 把那一管水份蒸发一下，就会变浓了。你的blunting是用Klenow 12/02 18:13
19F：→ Ice9: 吗？对了，片段补平之前，不太建议跑胶纯化。 12/02 18:16
20F：→ Ice9: 还有，你写到「一直卡」……那表示做了很多吧。可以全弄成同 12/02 18:18
21F：→ Ice9: 一管再将水蒸发一下，那不就会有更多更浓的insert了？ 12/02 18:19
22F：推 tony51501: 我觉得20～30ng蛮高的了，我做的insert 1.2kb左右 vect 12/03 11:20
23F：→ tony51501: or 5kb左右，都是从胶上萃下来，之後ligation也成功 12/03 11:20
24F：→ tony51501: 回溶体积32ul 12/03 11:21
25F：推 tynse71864: 浓度低没关系 还是丢丢看 ligation 机率好中了就中了 12/03 21:54
26F：→ tynse71864: xd 12/03 21:54
27F：→ tynse71864: 死马当活马医 ligation最後要求要10ul我30还是有成功 12/03 21:57
28F：→ tynse71864: xd 12/03 21:57
29F：→ tynse71864: 另外水可以蒸乾或浓缩 12/03 21:57
30F：推 ABULA666: 厂商给的回收率看看就好了...基本上抽不同大小的片段 12/03 22:29
31F：→ ABULA666: 回收率都部会不太一样，决定回收的效率主要就是看品牌， 12/03 22:31
32F：→ ABULA666: 如果是品质差的牌子怎麽抽都不会好，再来就看你的目标 12/03 22:32
33F：→ ABULA666: 片段多大，人为的差异...我想就一些小技巧可以弥补吧? 12/03 22:34
34F：→ ABULA666: 但决定性没有像牌子那麽重要 12/03 22:34
35F：推 tynse71864: 大象牌5-7成我觉得差不多 12/04 01:00
36F：推 jimmy80727: 回收少没关系阿 ligation照作中了就是你的 12/15 09:17