※ 引述《hachibuya (黄金骑士 牙狼)》之铭言： : 我实验室在测某种药物加到癌细胞後和放射线治疗的关系 : 药物的厂商有帮我们做DNA的microarray 看表现量的应该是mRNA microarray : 跑出来後蛋白质fibronectin有很明显如预期的差异 : (没加药global normalization为428, 加了药的降到215) : 因为只有microarry的data感觉很虚 : 所以老师说用realtime qPCR跑看看 : 我们的机器是Roche的LightCycler Nano : 一开始是用SYBR GREEN染, 对照组是用18S : 结果不同时间养的细胞做出来的结果很不一 : (对照组和加药组间的结果很不稳定 有时算出来是对照组高 有时加药组高 : 但相同sample做duplicate或triplicate是没问题的) : 甚至连相同的cDNA sample放了一周後也无法做出一样的结果 : 後来另一个老师说这可能还是手的问题 : 建议我用hydrolysis probe 可以同一个sample里染不同的cDNA : 照了建议重新设计买了primer和probe : 还有universal probelibrary GADPH的primer和probe : 结果是可以在同smaple同时做出两种基因的表现 : 但Cq值的relative 定量计算结果还是乱七八糟的 : 怎麽做都做不出microarry的结果 : 上网查了一下好像也没有定论说microarry和qPCR的结果一定会一样或不同 : 因为我不是生科本行出生的 不知道各为大大怎麽看? 1. mRNA microarray你们做了几重复? 如果只做一次的话，我只能说这个结果本身就不可信 任何实验没重复三次以上我都觉得可信度低 因为出来的结果可能会受到操作者手法的影响很大 超过三到五次都能重复才表示这个实验有再现性 2. 如果你们array的实验再现性很好得话 qPCR的验证请不要用syb，这个灵敏度只适合做差异度极大的样品 如果差异只是两倍的话，请用taqman系统的验证效力会比较好 3. 如果这样还是结果不一样表示?? (1) 养细胞有很多要注意的事项，是否有严格的遵守 尤其是这种放大表现得比较法，些微不同的培养 方式可能就会导致细胞本身表现出现异常。 (2) RNA转cDNA的kit可能不好，请去买做microarray 或NGS的转cDNA的kit来用。 4. Cq ratio 会乱跑表示实验有操作问题或是probe灵敏度 有问题，实验有问题通常都是出在sample preperation 的地方，我看过太多细胞实验结果都是因为microplasma 影响，导致只要一换clone实验就做不出来。 5. 我相信用以上的方法，你们可以得到一个较精准的答案 可能结果不一定跟你们想的一样，但是我相信至少结果 会很一致。 --

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