各位版友大大前辈们好 小弟最近实验想探讨在乳癌细胞中某non-coding RNA对於其 Target protein ubiqutination的影响 看paper几乎都是以IP的方式来做 原理大致上是把Target protein用抗体抓下来後 然後在western上用Ub的antibody来做hybridization 所以小弟我的实验设计也是仿照paper的模式 在MCF-7细胞建立Over-expression ncRNA及Control的Model後 隔天在收细胞前先以MG132(20uM)处理4h(也是参考paper的条件) 然後把细胞收下来後开始进行IP的实验 我的实验流程如下 1.先以RIPA buffer(sigma)冰上反应30min(每5min vortex 10s)，然後离心後取 上清液 2.Protein定完量後，固定为800ug protein为一个IP，总体积200ul，并留80ug protein 作为Input(先煮好，保存於-80) 3.先让Protein和G bead反应约6h，把会和G bead结合的protein分离出来 4.把剩下没和G bead结合的protein加入抗体(1:100)，4度C反应Overnight 5.隔天把G bead加进去，也是4度C反应Overnight 6.隔天用磁座把G bead-Ab-protein complex分离出来，用wash buffer洗三次5min 7.加入sample buffer後煮10min 8.Western blot 然後现在结果出来了不太理想，有几个问题 1.看paper Ub-protein没有只是单一条band而已，譬如我的target protein分子量在43kD ，理论上来说它在接上Ub後band会出现在43kD的上方连续好几条band，但是我的结果似乎 pattern没有和paper那麽像，只有两条band，位置出现在50kD和70kD附近 2.我的Negative control抓到很多很奇怪的杂band，而且有两条也在我预计想看的 protein相同位置上 跟老师和学长姐讨论之後，认为那些band都不是我要看的，简单来说就是有可能我的 Ab没有成功把target protein抓下来 目前我想到的解决方式有几个 1.先用WB测试我的target protein 有没有被Ab抓下来 2.提高IP反应Protein的量 3.外送Ub plasmid 想请问各位大大们还有甚麽其他意见吗??? 感激不尽~ --

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