IP中重要的是抗体的使用，文章有些说的不是很清楚，所以我想确认一下 ※ 引述《shinchenboy (欣承男孩)》之铭言： : 各位版友大大前辈们好 : 小弟最近实验想探讨在乳癌细胞中某non-coding RNA对於其 : Target protein ubiqutination的影响 : 看paper几乎都是以IP的方式来做 : 原理大致上是把Target protein用抗体抓下来後 : 然後在western上用Ub的antibody来做hybridization 你这边的抗体是只认Ub tag 还是 Ub 後的target protein? : 所以小弟我的实验设计也是仿照paper的模式 : 在MCF-7细胞建立Over-expression ncRNA及Control的Model後 : 隔天在收细胞前先以MG132(20uM)处理4h(也是参考paper的条件) : 然後把细胞收下来後开始进行IP的实验 你实验中是否有用到anti target-protein antibody ? 你的anti target-protein antibody是否可以在一般western下认到专一性的band 并且大小是你要的protein? 这抗体是否能同时认到 Ub-target protein? 过量表现或是抑制表现条件下的WB 此抗体是否能准确侦测到Ub-target protein or target-protein 的量上升或下降? : 我的实验流程如下 : 1.先以RIPA buffer(sigma)冰上反应30min(每5min vortex 10s)，然後离心後取 : 上清液 : 2.Protein定完量後，固定为800ug protein为一个IP，总体积200ul，并留80ug protein : 作为Input(先煮好，保存於-80) : 3.先让Protein和G bead反应约6h，把会和G bead结合的protein分离出来 : 4.把剩下没和G bead结合的protein加入抗体(1:100)，4度C反应Overnight 上面有提到你的WB是认Ub的antibody 推论你这边应该用anti target-protein antibody ? : 5.隔天把G bead加进去，也是4度C反应Overnight : 6.隔天用磁座把G bead-Ab-protein complex分离出来，用wash buffer洗三次5min : 7.加入sample buffer後煮10min : 8.Western blot 详细的1抗2抗能否提供? : 然後现在结果出来了不太理想，有几个问题 : 1.看paper Ub-protein没有只是单一条band而已，譬如我的target protein分子量在43kD : ，理论上来说它在接上Ub後band会出现在43kD的上方连续好几条band，但是我的结果似乎 : pattern没有和paper那麽像，只有两条band，位置出现在50kD和70kD附近 你做的protein和paper是同一颗? 另外感觉你这边似乎没做 过量表现该Ub-蛋白质之前和之後的一般WB 不然应该已经先确认过该Ub-蛋白质大小才对，直接跳到IP不太妥当 先确认你的细胞过量表现前後的WB，先看看你的蛋白质的大小及分布 万一你蛋白质的一般WB 跟你的IP後的WB 大小完全不一样... 就会有是否真的抓到同一颗蛋白质的疑虑... : 2.我的Negative control抓到很多很奇怪的杂band，而且有两条也在我预计想看的 : protein相同位置上 能否详细说明下你的Negative control是拿甚麽东西做呢? 一般细胞? 不表现该蛋白质的细胞? 不过既然有杂band的话，理论上你的实验组应该也要有杂bands才对... 有可能就是单纯的Negative control污染或是没洗乾净... 另外可以多做一个WB测试你的pellet有无actin 或 tublin 或其他house-keeping genes 看看你是否每组实验组和控制组都有洗乾净， 有可能会发现Negative control没洗乾净，而实验组有洗乾净 : 跟老师和学长姐讨论之後，认为那些band都不是我要看的，简单来说就是有可能我的 : Ab没有成功把target protein抓下来 : 目前我想到的解决方式有几个 : 1.先用WB测试我的target protein 有没有被Ab抓下来 : 2.提高IP反应Protein的量 : 3.外送Ub plasmid : 想请问各位大大们还有甚麽其他意见吗??? 感激不尽~ 可以多放一组一般细胞和过量表现的细胞的控制组说明你的蛋白质bands是哪几条 IP有时候会抓到奇奇怪怪的东西，也许是新的研究方向? 以上参考 --

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