补充一些可以考虑的点 ※ 引述《shinchenboy (欣承男孩)》之铭言： : 各位版友大大前辈们好 : 小弟最近实验想探讨在乳癌细胞中某non-coding RNA对於其 : Target protein ubiqutination的影响 : 看paper几乎都是以IP的方式来做 : 原理大致上是把Target protein用抗体抓下来後 : 然後在western上用Ub的antibody来做hybridization 同前一篇 patricksky 大及其他人所言 你有用过这抗体先测试做 IP 或 WB 吗? 理想状态下 你应该要有两只对你的目标蛋白质具专一性且能用在 IP 与 WB 的抗体 然後拿一只来做 IP 另一只做 WB : 所以小弟我的实验设计也是仿照paper的模式 : 在MCF-7细胞建立Over-expression ncRNA及Control的Model後 : 隔天在收细胞前先以MG132(20uM)处理4h(也是参考paper的条件) MG132 的使用需小心 首先 MG132加到培养基中会立刻结晶沉淀 要注意摇匀的问题 其次你有没有做浓度与时间曲线 找出最适合你实验的处理条件 最後 对某些蛋白质而言 加入 MG132反而会改变其表现 : 然後把细胞收下来後开始进行IP的实验 : 我的实验流程如下 : 1.先以RIPA buffer(sigma)冰上反应30min(每5min vortex 10s)，然後离心後取 : 上清液 你有没有加入 de-ubiquitinylating inhibitors? 例如 NEM, IAA, PR619等 没加的话 Ub 会在实验过程中丧失 你预期的 band 会消失 : 2.Protein定完量後，固定为800ug protein为一个IP，总体积200ul，并留80ug protein : 作为Input(先煮好，保存於-80) : 3.先让Protein和G bead反应约6h，把会和G bead结合的protein分离出来 : 4.把剩下没和G bead结合的protein加入抗体(1:100)，4度C反应Overnight : 5.隔天把G bead加进去，也是4度C反应Overnight 抗体与 beads 间有没有做 cross-linking? 特别是你的蛋白质与泛素化後的蛋白质分子量是在一个尴尬的位置 IP 後如果抗体跟着蛋白质一起被洗出 WB 时你就会看到抗体的 band 了 : 6.隔天用磁座把G bead-Ab-protein complex分离出来，用wash buffer洗三次5min 你的 wash buffer 是什麽? 够不够 harsh? 这里需要一个够 harsh 的 wash buffer 把所有非专一结合的杂质蛋白质全洗出去 只留下你与抗体稳定结合的目标蛋白质 但要这样做前提是你务必要做 cross-linking : 7.加入sample buffer後煮10min : 8.Western blot : 然後现在结果出来了不太理想，有几个问题 : 1.看paper Ub-protein没有只是单一条band而已，譬如我的target protein分子量在43kD ~~~~~~~~~ 这在说什麽? : ，理论上来说它在接上Ub後band会出现在43kD的上方连续好几条band，但是我的结果似乎 : pattern没有和paper那麽像，只有两条band，位置出现在50kD和70kD附近 : 2.我的Negative control抓到很多很奇怪的杂band，而且有两条也在我预计想看的 : protein相同位置上 同 patricksky 所问, Negative control 是什麽? 你有没有同时跑两片 WB? 一片用你手上有专一性, 可辨认目标蛋白质的抗体跑 另一片用可辨认 Ub 的抗体如 FK1, FK2, P4D1 染 再来交叉比对 band 的位置 就可以推论出哪些 band 是有 Ub 的 band : 跟老师和学长姐讨论之後，认为那些band都不是我要看的，简单来说就是有可能我的 : Ab没有成功把target protein抓下来 : 目前我想到的解决方式有几个 : 1.先用WB测试我的target protein 有没有被Ab抓下来 基本一定要做的 : 2.提高IP反应Protein的量 不预期会有效果 : 3.外送Ub plasmid : 想请问各位大大们还有甚麽其他意见吗??? 感激不尽~ --

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