作者PumpkinHead (PumpkinHead)
看板Biotech
标题[求救] 牛巩膜细胞primary culture
时间Thu Dec 31 14:59:01 2015
各位大大好，小妹因为实验需要进行牛巩膜细胞的primary culture
因为实验室里没有人做过同样的实验，所以一直以来小妹都在摸索
不过结果一直不是很理想，想请问各位大大是不是有相关的经验可以分享，拜托拜托><
小妹感激不尽~~~
以下是小妹的protocol:
1.准备需处理用器械及容器，清洁并灭菌完成
2.取2个500ml大烧杯(已灭菌)，一个放优碘，一个放PBS+0.05%EDTA
3.将眼球周围的肉去掉，倒入优碘，浸泡5min
4.在hood里准备3个dish，将PBS+EDTA倒入烧杯及dish中
5.将眼球移到hood中，浸泡在PBS+EDTA中洗掉优碘
6.用手术刀於角膜上划一刀，剪下角膜及巩膜
7.一边用scraper刮除视网膜及脉络丛，一边用PBS+EDTA清洗巩膜，重复3次
8.浸泡於Dispase II(0.8U)+DMEM(含抗生素，不含血清)，4度C，overnight
9.取出巩膜，用PBS+EDTA洗三次，同时用scraper刮巩膜表面
10.剪碎巩膜，之後用PBS+EDTA wash X3
11.将组织碎块浸泡於collagenase type II(4mg/ml)+DMEM(含血清)中，37度C，5%CO2
2hr
12.用PBS+EDTA清洗，过滤
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立
正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
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1F：推 caesar0926: 做过小鼠角膜的，medium很重要，你的问题在哪?? 01/01 16:04※ 编辑: PumpkinHead (1.160.39.194), 01/02/2016 16:40:23
过滤之後细胞数不多，甚至没有，不过在digest过程中，显微镜下有看到细胞黏在组织上
过滤前我也有稍微pipet一下
※ 编辑: PumpkinHead (1.160.39.194), 01/02/2016 16:42:37
※ 编辑: PumpkinHead (1.160.39.194), 01/02/2016 16:46:39
2F：推 LIAR: 细胞名称是什麽？ 01/02 22:51
Bovine scleral fibroblast
4F：→ LIAR: 这边只用一小时。有的protocol有强调细胞混很脆弱，所以分两 01/02 23:08
5F：→ LIAR: 段，先一小时收一次，再继续处里剩下的到4小时。 01/02 23:08
7F：推 caesar0926: 之前没有过滤的步骤，不知道用意是什麽?? 01/03 23:33
因为digest过後还是会有组织碎块，所以会过滤，将剩下的组织块过滤掉
8F：推 caesar0926: 还有一个问题你把眼睛浸优点吗??当初我分小鼠角膜细胞 01/03 23:35
9F：→ caesar0926: 时，是用泡PBS+抗生素去避免污染 01/03 23:36
我有做过角膜的fibroblast，也是泡优点，所以这方法应该是可行的
10F：→ caesar0926: 优点我过分keratinocyte的前辈用过..不过他是用尾巴 01/03 23:37
11F：→ caesar0926: 是不清楚眼睛这样可不可以... 01/03 23:37
12F：推 LIAR: 我角膜内皮也是优碘，不过毕竟内皮比较乾净，加上有人认为 01/04 00:58
13F：→ LIAR: 优点要乾掉才有用，所以我也不确定这到底有没有用 01/04 00 01/04 13:
※ 编辑: PumpkinHead (140.112.137.71), 01/04/2016 13:39:42