作者s992003 (Lord of Ethanol)
看板Biotech
标题[求救] PCR突然做不出来
时间Mon Jan 18 21:18:20 2016
各位大大好
首po有不对的地方见谅
小弟之前有爬文看过pcr时有时无那篇
但好像没有找到答案
小弟的pcr条件:
模板vector大小5.7kbp ，其中900多bp是我想放大的片段
primer F 长度26bp Tm70.6 GC73.1%
primer R 长度53bp Tm67.5 GC41.5%
模板浓度 0.5ng/ul
primer浓度 两个都是0.25uM
PCR温度
95度5分钟
95度30秒, 60度30秒, 65度6分钟 循环35次
65度7分钟延长
最早之前在extension温度68度 都做不出来
後来改成extension 65度的条件就p的出来
重点是
我大概2~3个月前换成extension 65度p出来之後，怎麽p都不会失败
中间两个月没做pcr之後到现在，有一些原因要再回头p，用一样的条件怎麽p都是没有任
何产物，就在电泳胶的最底下糊糊一小片而已
kit是用一模一样的，而且新开的跟旧的都做不出来
模板vector DNA重新摇菌再抽过，新旧vector都p不出来
primer stock浓度100uM 溶剂为一般DDW，冰-20
有可能是primer当初没有使用灭菌水配stock solution吗
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1F：→ IMR32: 建议你加一下3-5%DMSO 01/18 22:20
小弟不是专业的，想问DMSO在这边的作用是?
2F：→ blence: plasmid templateㄟ,以为随便加就有了 01/18 22:39
3F：→ blence: 一般来说extension 68度没东西不是要提高温度吗,怎是降低? 01/18 22:42
但真的做得出来的时候，草率的加一样都会出来，做了十几次都没失败，
跟老师讨论後是猜测68度超过我们primer的Tm值导致primer还没来得及做就脱落了，
但结果似乎证实我们的假设正确，改低之後成功做出
4F：→ jabari: ..嗯... 先来管新的primer 再跑一次gradient就知道了? 01/18 22:47
这实验快放弃了XD可能不会买新primer
5F：→ Ice9: 应该有Vecter上既有的primer可以当control吧？觉得是你引子 01/19 01:27
6F：→ Ice9: 出差错了。 01/19 01:28
会尝试这个trouble shooting，谢谢!
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/19/2016 15:42:36
7F：→ IMR32: 因为你的引子长度差太多，就在这周，学弟也是类似的问题 01/19 16:19
8F：→ IMR32: 一样是以plasmid当template，两primer一长一短，低温时产物 01/19 16:21
9F：→ IMR32: 长度不对，高温时，全部都是primer dimer 01/19 16:23
10F：→ IMR32: 第三次就加3%DMSO+gradient，结果任何温度都有出来 01/19 16:25
11F：→ IMR32: 因此你的问题，我认为是长的那一条没有解开所致，至於DMSO 01/19 16:28
这边小弟不太懂,不是95度就几乎完全展开,然後降温之後互补的primer黏上,接着升温开始延长
整个过程是在哪一个环节上,使较长的primer容易脱落之後能改善PCR结果呢?
12F：→ IMR32: 你可以查询dmso VS pcr，若实验室有闲钱，也可用BETAINE 01/19 16:29
13F：推 tynse71864: dmso会降低 Tm值 ，但会增加非专一辨识 01/19 16:32
14F：→ huuban: 那通常PCR extension都在72度，primer怎麽不会掉? 01/19 23:01
小弟有点算跨领域实验吧,很多细节都无法参透,但确实在降低extension温度之後成功做出,
而且是可以重复的,似乎我们这个假设是正确的?
能在72度工作的primer是否Tm值或者GC%较高呢?
15F：→ huuban: 为什麽你65度要6分钟...这是哪支polymerase..我想认识 01/19 23:02
16F：推 roy047: 900bp要做6分钟真的超久orz 01/20 02:30
protocol给的标准温度是68度,所以我们认为65度会降低反应速率,会需要更长的时间,
因为我们目的也只是要能重复做出来就好了,就先不改条件了,所以这个时间是没有最佳化过的
17F：→ WinnieDad: 可能误以vector大小5.7kbp计算extension的时间吧？ 01/20 13:28
18F：→ xxtomnyxx: 可能是因为65不是polymerase最佳作用温度所以才要那麽 01/20 14:35
19F：→ xxtomnyxx: 久？ 01/20 14:35
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 17:04:08
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 17:05:05
20F：→ IMR32: 95是解开了，但回来72or68时，primer自黏比黏template高时 01/20 17:41
21F：→ IMR32: 就会没0.9k只会有一两百b.p.的primer dimer，因此若是你发 01/20 17:43
22F：→ IMR32: 现主产物是一两百的话，建议你加DMSO，annealing tem.直接 01/20 17:44
23F：→ IMR32: 72，elongation一分钟即可，我建议你做看看，不到一小时半 01/20 17:46
24F：→ IMR32: 就可确定 01/20 17:46
25F：→ IMR32: 但我发现你短primer只有26，你有确定可黏上的部分有超过18? 01/20 17:47
了解了谢谢你,短primer的26个是完全互补,长primer则有30个完全互补
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:06:59
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:10:45
26F：→ blence: 整个实验条件修改的方式不合理 01/20 18:17
27F：→ blence: 既然长primer只有30配对,Tm一定会更低,应该先降60而非68度 01/20 18:18
28F：→ blence: 除了anneal可调整,一般extention设定在68~72其实不会动 01/20 18:19
29F：→ blence: 会动extention主要是希望降低速度减少突变,而非增加anneal 01/20 18:21
30F：→ blence: 除非实验有特殊目的,不然应该舍弃现有条件,依照通用protoc 01/20 18:25
有想过primer可能黏不上,之前annealing温度从40~65都试过,记得是都没有产物所以去改
extension温度看看,只是当时改条件之後突然一直都做得出来了,所以一直认为假设正确,
但实际情形可能要靠各位大大指教
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:36:53
31F：→ blence: 你们是以plasmid当template,Tm低一点也不用担心杂band 01/20 18:32
了解!谢谢大家的意见,目前实验结果是加了1%DMSO马上就出现产物,但并不是非常专一,
我的目标大小是主要产物,但有较少量的杂band以及smear的情形,我会再调整条件看看
所以我之前的情形应该如IMR大大所说,倾向於primer自黏
※ 编辑: s992003 (36.237.23.151), 01/23/2016 14:20:30