我将930bp的insert放入47xx bp的vector ligation的产物有放进comptent cell筛选抽出plasmid 後来切一刀跑胶看大小比6000少一点，符合预期 也有跑切了一刀的空vector 分子量比5000少一点，也符合预期 用pcr检查insert不成功有许多杂band，还在重新尝试 这个clone的产物我是要接着做bac to bac的实验，将新plasmid放进DH10bac的comptent cell上，使我的insert被Tn7夹进bacmid中，完成病毒DNA 问题是我放新vector进去後，涂盘都不会长菌，我连蓝白筛的步骤都到不了 加入plasmid後有摇SOC medium，菌没死 代表我的菌可能没有吃进plasmid，或者就是吃进去没有发生重组，那这就代表我的plasm id基因是错的所以不会重组 也有做空的vector，就有长出蓝白的菌株 代表空的vector没问题，菌也没问题 怀疑transform没进去，还尝试两次heat shock，菌也没死，但涂盘还是不会长 後来怀疑有重组的菌太少，摇5ml的菌 o/n，然後低速离心，抽取部分上清液，用较浓的菌液涂盘，一样什麽都没长 结论是我有做空vector的ctrl，表示手法跟comptent cell跟vector本身是没问题的，但 我vector跟insert做clone之後就坏了 但是奇怪的是我的clone产物大小正确，也能用通过抗生素筛选，就算我insert出问题，v ector还是原来的DNA序列，重组也应该要发生，做DH10bac的comptent cell也应该要长出 菌 请问各位大大ligation有可能做出产物但DNA序列 mutant掉吗 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 111.82.44.202 ※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1453535589.A.523.html 定序结果不理想,讯号杂乱,厂商再次尝试之後表示无法成功定序 但抽出的质体明明很纯,浓度也还OK有500ng/ul,我用insert的primer跟vector上的primer 都定不太好...囧,感觉我的vector变了 我们当初有考虑blunt end会有太多副产物,所以用sticky end来接合 实验结果是确定接出东西,大小符合,且含有抗生素耐性,也和空vector切一刀比对 排除了vector自接的假讯号 所以尽管定序方面不理想,老板也认为接出来了,才叫我接着做 Protocol是说heat shock之後用SOC培养4小时,然後第一次失败了之後我们培养6小时,部分涂盘 剩下的再加SOC继续放大,浓缩之後再次涂盘,最後不管摇4小时还是6小时,或者之後放大的浓菌 都无法长出任何菌株,有怀疑我置盘跟过程有出错,但用空vector做ctrl一次就成功 ※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/26/2016 15:43:08 ※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/26/2016 17:15:13 有三种抗生素,我看原文protocol的工作原理,应该是pFastbac1这个vector上的T7会夹一段 基因进去bacmid中,而原先pFastbac抗gentamicin的基因序列是反着的,无法抗gentamicin,但是夹入bacmid之後才能正常表达抗gentamicin的基因 原文protocol是说空的pFastbac1 vector在transform进去DH10bac之後,透过T7将一段DNA 夹进去(包含抗gentamicin基因),此时重组完的bacmid才能抗gentamicin,内容提到这是一 个positive control,因为我的vector跟原来vector相比就是多一段我外加的insert而已 具有抗生素耐性的基因还是在vector本身吧,所以空的vector应该要长?因为有转入抗 gentamicin的基因,而且基因表达方向正确? ※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/27/2016 16:32:16 ※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/27/2016 16:35:04 定序做了一些尝试都不太行,不是没讯号就是讯号杂乱,无论从insert端还是vector上, 切一刀的用意不是确定切位,是想让vector呈线性然後就可以看到正确的分子量大小,因为 supercoil很难看出正确大小 但小弟现在比较不解的是,好就算我放进去的insert是错的,但我的产物跟原始vector一样 能抵抗amp,所以vector的序列应该没错才对,就只是在切点中插入一段未知的序列,它该有 的vector功能还是应该要存在 毕竟我就是拿那个纯的vector切两刀然後纯化在去跟切两刀的insert进行ligation, 就算我做成vector自接,它也是要具备vector的功能,能转入bacmid中才对 奇怪的是我就从那个胶切出来怎麽会跑出一个分子量一样大的vector然後能跟原来vector 一样能抗其中一种抗生素,但其他部分的基因好像完全不一样似的,这假讯号也太巧了吧.. 除非接进去的insert上的基因能表达出一些东西破坏其他基因的正常表现... 其实insert在接进去前有定序一次,正确无误就是了 是用i牌贵松松的,所以前面两三次没做出来,老板就叫我不要做太多尝试,先找出错的地方 但用没接进insert的vector一次就成功...如果接进insert也才多900多bp,转入bacmid的 效率应该不会因为这900多bp而差太多吧 ※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 01/28/2016 16:09:41