作者sylvialalala (sylvia)
看板Biotech
标题[求救] PCR达人请教 一段怎麽p都p不出来的区域
时间Thu Jan 28 10:44:54 2016
想请教ＰＣＲ达人 有关一段怎麽Ｐ都Ｐ不出来的genome区域(昆虫)
我之前从没遇过这样的问题....已经不知道如何解了
图示primer设计
A_F B_F B_R A_R
B这段区域约300 bp 是可以成功的
有问题的是A这个区域 约1500 bp
怎麽p都p不出来 （前後已经设计10对primer 交叉互p也都不行）
只有一对有微弱的band 但是不是每个sample都有
试过的条件： TM: primer tm约50~52 每个温度都有试过 (目前顷向再跑gradient)
mgcl2 2mM （虽然也可以跑gradient 但因为连band都没有我觉得应该无效）
虽然gc约只有33% 但有试过final 1mM betaine 无效
A_F/B_R 或是B_F/A_R 也失败 (这里的A有大概五对primer在试)
请教达人我还可以怎麽试呢？
有增加dna template到2ul 但还是没改善 (有用positive确认过dna ok)
谢谢！
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1F：推 micocat: 用Taq批看看?! betaine应该是对 GC rich有帮助 01/28 12:36
目前是用invitrogen的amplitaq 也有换过master mix or kapa的taq 还是无法p
→ hitmd: 用哪一支polymerase?
invitrogen的amplitaq 01/28 13:07
2F：→ xxtomnyxx: 1. 加 DMSO 3~10% 01/28 13:38
已试过betaine 或是dmso跟betaine作用不一样？
3F：→ xxtomnyxx: 2. 增加 denature and/or annealing 的温度和时间； 01/28 13:38
有试过各种annealing了 但denature的温度与时间不同会有帮助？
4F：→ xxtomnyxx: 3. 降低 template DNA 的量； 01/28 13:40
有试过1, 2ul 但似乎dna越多p的band越明显一点
5F：→ xxtomnyxx: 4. 增加 initial denature 的时间 01/28 13:40
6F：→ xxtomnyxx: 5. 换 Phusion polymerase 01/28 13:40
这就要另外买了.....
7F：→ xxtomnyxx: 另外，你确定你手上的昆虫 genome 序列是完整正确的？ 01/28 13:41
确认是正确的
8F：推 jabari: roche probemaster... 不过是dUTP. 囧b 01/28 15:33
9F：→ Ice9: construct用吗？为什麽要那麽长？还有不同sample? 另外，GC 01/28 22:06
10F：→ Ice9: content有时并不一定要看目标产物的全长。某一段内有密集出 01/28 22:07
11F：→ Ice9: 现到70-80%以上，甚至是primer附近就有一小段时也要考虑进去 01/28 22:09
12F：→ Ice9: 还有，大的做不了，分成两三段再接合也是可以想一想的。 01/28 22:11
13F：→ Ice9: 若是做类似监种比对，试过degenerate primers吗？或是像在做 01/28 22:17
14F：→ Ice9: RACE PCR 一样的方法做设计？ 01/28 22:18
两三段接合也是无法p (aF/bR bF/aR p不出)
不是监种 是要看mutation有无成功
degenerate primer??可以麻烦说详细一点吗？
今天try增加到80 cycle (40+40) 还有annealing 跑gradient试试
※ 编辑: sylvialalala (129.85.224.239), 01/29/2016 02:09:07
※ 编辑: sylvialalala (129.85.224.239), 01/29/2016 02:10:14
15F：→ Ice9: 如果不是监种，而是针对已知序列中的某一段做确认，那就不需 01/30 20:09
16F：→ Ice9: 要degenerate primer了。 然後，你是哪种 mutation？ 01/30 20:10
17F：→ Ice9: 呃，抱歉，我是想问你做的研究是想分析哪种 mutation? 01/30 20:17
18F：推 micocat: betaine内文提到是加1mM，不知道是不是笔误，建议加1M 01/30 21:46
19F：→ micocat: 另外genomic DNA denature建议设高一点，98℃或96℃ 01/30 21:48
20F：→ micocat: 不过taq可能称不太住，调高温度的话taq可能要加量 01/30 21:49
21F：→ micocat: 另外，要确认有没有突变怎麽不是用proofreading enzyme? 01/30 21:50
22F：推 ookubo: extension时间? 02/05 04:46
23F：推 jabari: 有时侯就是P不了 建议原po去查看看有没有其他资料库ngs的 02/05 16:45
24F：→ jabari: 结果 我前几年也遇到怎样也p不到 丢ngs回来coverage超差 02/05 16:45
25F：→ jabari: 然後insel没人有定论的片段 .... gDNA不行就换从rna下手 02/05 16:45
26F：→ jabari: 吧 囧 02/05 16:45
27F：→ satasumi: PRIMER...多长? 05/13 00:14