作者tijkhj (ㄚJ)
看板Biotech
标题急!! western blotting 一直压不出来?
时间Wed Mar 30 23:52:30 2016
首po 排板有问题 敬请见谅
小妹我在western上卡关卡很久 想请教有经验的大大们~~~一点小撇步 来做改善
我用细胞萃取蛋白质去跑的 要压的东西是IRS-1(和磷酸化的IRS-1) 但一直都压不出东
西 不知道有没有有压成功的大大 可以提供一点意见 我一抗用1:1000 二抗用1:3000
不知IRS-1是不是要萃到细胞膜才压的出来 还是需要在做什麽来加强 才有办法~~
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1F：→ sunorange: western 没出来 ，可能的问题有太多了 03/31 00:01
2F：→ sunorange: 这个蛋白没有很难压 ！你先把positive 做出来 03/31 00:02
3F：→ Ianthegood: 什麽细胞 多少细胞 蛋白怎麽抽 loading control 03/31 00:36
4F：→ Ianthegood: 有没跑sds page 有没染ponceau positive有没压出来 03/31 00:37
5F：→ Ianthegood: 一抗是哪只 二抗是哪只 大概的protocol 03/31 00:38
6F：→ Ianthegood: 照你给的资讯就能debug出来大概可以去当算命仙了... 03/31 00:40
7F：→ tijkhj: 我的实验细胞是c2c12 细胞是用lysis buffer粹 一抗是IR 03/31 01:02
8F：→ tijkhj: S-1 二抗是老鼠 同一片胶actin都有出来就只有IRS-1没有 03/31 01:02
9F：→ tijkhj: 蛋白浓度度用到60ug 03/31 01:03
10F：→ blence: 如果很急，何不把内容讲清楚? 还是不是从头到尾做过? 03/31 01:15
11F：→ Ianthegood: 问抗体是哪只的时候往往是在问番号 网路上几乎都找的 03/31 01:15
12F：→ Ianthegood: 到评价 03/31 01:15
13F：→ Ianthegood: 还有你不会认为全天下的"lysis buffer"配方都一样吧 03/31 01:16
14F：推 MDM2: 细胞整颗拿去煮 不要离心 03/31 12:28
15F：推 tz2733: 试过1抗hy o/n吗? 提高一抗浓度? 03/31 14:33
16F：推 michealking: lysis buffer要注意一下你的inhibitor 03/31 14:37
17F：→ michealking: western环节很多 出错就GG 写仔细一点吧 03/31 14:38
18F：推 leptoneta: 没有cat. number连有没有用错二抗都不知道好吗... 03/31 20:43
19F：→ jsi: 是压endogenous or over-expressed IRS-1? 刚刚看了一些抗体 03/31 21:45
20F：→ jsi: 公司的WB图，大多都有先刺激细胞或IP後再做WB. 推二楼说的， 03/31 21:49
21F：→ jsi: 先去找确定有表现IRS-1的细胞作为positive control，来证实你 03/31 21:51
22F：→ jsi: 用的抗体是有效的，或者换个人做做看，可能可找到问题所在。 03/31 21:52
23F：→ tijkhj: 一抗cat.#2390和#3203 04/01 02:23
24F：→ tijkhj: 不好意思 想请问什麽是刺激细胞 04/01 02:26
25F：→ tijkhj: 我的做法是细胞分化完 再投药等药物作用时间到了之後收细 04/01 02:35
26F：→ tijkhj: 胞 为了可以压出磷酸化的东西 也有在lysis buffet加入磷 04/01 02:35
27F：→ tijkhj: 酸酶抑制剂 等变性完後 就开始做WB的步骤 其它要跑的东西 04/01 02:35
28F：→ tijkhj: 都有压出来 就只有这个没有 以前曾经有压出过 但就只有那 04/01 02:35
29F：→ tijkhj: 麽一次而已 04/01 02:35
30F：→ blence: 做不出来才是正常的，有band才有问题 04/01 02:39
31F：→ blence: 用CST与Abcam(epitomics系列),尤其新手务必注意Rabbit mAb 04/01 02:40
32F：→ blence: 该用的二抗,多了解实验细节,才不会遇到这类非技术上的失误 04/01 02:46
34F：→ tijkhj: 二抗用的是Rabbit mAb 前面打错了抱歉 04/01 16:36
35F：推 ararthur: 是total form也压不出吗? 还是只有phospho-IRS-1? 04/03 03:00
36F：→ ararthur: blocking buf 跑磷酸化蛋白建议用BSA泡不要用Milk 04/03 03:01
37F：→ tijkhj: 两个都压不出来 blocking buffe 用5%的BSA 用TBS-T配 04/03 12:33
38F：推 tz2733: 抗体有reuse吗?新配试看看? 04/03 19:54
39F：→ tijkhj: 会重复使用 我重配试试看 可以请问有压过的前辈 这两个容 04/03 21:58
40F：→ tijkhj: 易压吗？ 04/03 21:58
41F：推 ararthur: 我是做adipocyte tIRS非常容易压 pIRS则比较难一点点 06/15 12:30