作者bill00202000 (handsome)
看板Biotech
标题[求救] 解决置换buffer而蛋白沉淀
时间Sat Apr 16 14:49:55 2016
我的目标蛋白是从大肠杆菌破菌得到，藉由NI-NTA纯化，最後用elution(50mM NaH2PO4,
300mM NaCl,250mM imidazole,pH 4)洗出蛋白，因为最後要置换成PBS(pH 4)，所以
elution直接调成pH4而不是8，我的PBS是以50mM NaH2PO4 + 150mM NaCl与50mM H3PO4
+ 150mM NaCl互相调至pH 4，那是以浓缩管进行至换，可是置换後蛋白会有白色沉淀出
来，所以想请问大家由何种方法可以解决，我後续要用pH 4环境作用，ph无法辨更，
感谢大家的解答
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1F：→ blence: 好奇一问,PBS如其pH buffer功能,如何调到pH=4? 04/16 16:45
2F：→ Ice9: 这个应该是指一般的PB solution而不是saline。我猜可能是pH 04/16 17:53
3F：→ Ice9: 变化太快？能用pH梯度缓缓替换吗？pH 8 --> pH 4。 04/16 17:59
4F：→ Ice9: 还有你的目标蛋白需要金属离子来构形的话，可能也会有些问题 04/16 18:10
5F：→ Ice9: 另外，有时候换换 His-tag 的位置会有不同效果。 04/16 18:10
6F：推 jabari: 算PI... 不行就去找PI 04/16 19:22
elution已经用pH 4来洗出蛋白，我再置换pH应该不会变化太大?
蛋白pI是5.23
※ 编辑: bill00202000 (140.120.104.80), 04/16/2016 20:04:36
※ 编辑: bill00202000 (140.120.104.80), 04/16/2016 20:06:04
7F：→ kg9101266: 改成透析膜看看，有的蛋白对盐浓度敏感，也可考虑+DTT 04/17 00:25
8F：→ kg9101266: 透析膜O/N缓速置换溶液 04/17 00:26
9F：推 july81212: pH4 PB的缓冲不好看要不要换其他buffer 04/17 03:57
10F：→ july81212: 比较稳定 04/17 03:57
11F：推 Ianthegood: 如果mwco许可dialysis应该是最安全 不然centricon浓缩 04/17 08:23
12F：→ Ianthegood: 稀释循环也可以 比较费工一点就是了 04/17 08:23
13F：推 Ianthegood: 忽然想到 如果透析8->4 经过pI 蛋白会不会掉出来啊 04/17 08:27
14F：推 jabari: 5.3差一个pH log 可能不够力 试试正常3.0~3.5 elute再滴回 04/17 20:48
15F：→ jabari: 4看看? 真的不行的话改回imidazol试试? 04/17 20:48