作者ccclaz (ccclaz)
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标题[求救] PCR一直smear
时间Fri Apr 29 09:50:08 2016
<补充>
先前长官给我一个10K plasmid跟一对完全互补的primer
要我做mutagenesis 直接P出一个完整的plasmid
先列PCR的条件
10K plasmid 2 ul
10uM primer 1 ul
Phusion pol. 0.5 ul
2.5mM dNTP 4 ul
5x buffer 10 ul
10% DMSO 15 ul
ddH2O 17.5 ul
----------------------
Total 50 ul
因为primer彼此完全互补(迫於无奈不能改QQ)
一般PCR只会产生primer dimer
我使用two-stage PCR来跑
98C 30sec
98C 10sec┐
50C 30sec│5 cycles
72C 3min ┘
Mix
98C 10sec┐
50C 30sec│30 cycles
72C 3min ┘
72C 10min
但目前只能跑出一堆smear
http://i.imgur.com/NNVjpwZ.png
上图lane2~lane8为跑gradient 60C~50C的结果
现在我试过的条件如下
1.primer预测Tm为50 跑gradient50~60皆smear
2.Plasmid约10K 测试过20ng和2ng皆smear
3.primer测试过0.2uM 0.02uM皆smear
4.Taq测试过减半用量皆smear
5.cycle数降低为3+25皆smear
想请问还有什麽方法可以尝试
感谢大家
--
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1F：→ Ice9: 真不能换 primer? primer长度多长？可有再延长设计的可能？ 04/29 09:55
27个mer 我只是个菜鸟助理 现阶段的处境就只能先试条件
2F：→ Ice9: 然後，10K 产物用 Taq? 有一定程度的 mutation 耶。 04/29 09:56
Pusion polymerase其实不算Taq 我只是怕有人没听过 那我改一下好了
3F：推 pwl: 不晓得你有没有试过DMSO？ 04/29 11:29
有喔
4F：→ pwl: 抱歉，漏看条件了，原来已经加了 04/29 11:30
5F：推 huuban: 如果是Phusion做10k应该没有问题，我认识的Phusion不是Taq 04/29 12:13
你是对的
6F：→ huuban: template做别的PCR能做出东西吗？搞不好根本坏了 04/29 12:14
没试过P其他东西 那但我有自己重新转殖抽plasmid 新旧结果一样
7F：→ huuban: primer TM可否再拉高？ 04/29 12:15
嗯 我试试
8F：→ blence: 完全互补又不能改的primer好像早期stratagene的Quikchange 04/29 16:47
9F：→ Ianthegood: phusion改版过喔 primer试0.5uM看看 然後我会把single 04/29 20:19
10F：→ Ianthegood: side再拉到10 cycles 04/29 20:19
所以你觉得要提高primer量?
另外first stage增加cycle数不会像用PCR product当template一样非常容易smear吗?
虽然我目前的状况也很像这样orz
11F：→ xxtomnyxx: 你的 template 10K 然後你要从上面 P 多大的片段？ 04/29 21:30
12F：→ xxtomnyxx: Phusion 我通常超过 3K 的都用 1 kb/40sec 去做。 04/29 21:31
13F：→ xxtomnyxx: 我看你来你这个 smear 技不向 template DNA 也不像做 04/29 21:32
14F：→ xxtomnyxx: 不完整的 amplicon...... 可以给 marker 的大小吗？ 04/29 21:32
sorry我讲的不够清楚
<补充>
先前长官给我一个10K plasmid跟一对完全互补的primer
要我做mutagenesis 直接P出一个完整的plasmid
我是用1 kb/15sec来做的
另外下面是我用的ladder
http://i.imgur.com/Y7cyrbZ.jpg
※ 编辑: ccclaz (118.167.200.167), 04/29/2016 23:06:12
15F：→ blence: 我觉得你没说清楚是site-direct,是很大的误导, 04/29 23:19
16F：→ blence: 出问题的点已不只是pcr条件,连要mutation的设计也要存疑 04/29 23:22
17F：→ blence: phusion有出mutagenesis的kit,可以照它protocol修改一下 04/29 23:23
18F：→ blence: 追根探讨,上面的人得让你多了解细节,才能更快解决问题 04/29 23:26
19F：→ blence: 补充下,phusion已不用完全配对了,所以才说上面的人要费心 04/29 23:29
20F：推 jeol1620: 试试看 68℃ 1kb/30sec 或是反应液陪完再多加0.5ul taq 04/29 23:39
21F：→ xxtomnyxx: 我确定一下，你的 primer Tm 是照 Phusion 的算法算的? 04/30 01:54
22F：→ xxtomnyxx: Phusion 的 Tm 跟普通 primer 在用的不一样，然後请改 04/30 01:55
23F：→ xxtomnyxx: 用 1 kb/40 sec 试试看。 04/30 01:56
24F：→ xxtomnyxx: 另外，用完全互补的 primer 做 SD mutagenesis 是否搞 04/30 01:59
25F：→ xxtomnyxx: 错了什麽？怎麽跟我印象中的做法不一样？ 04/30 02:00
26F：→ soom: 推荐这篇 #1EmunDcy 改方法再定一个primer但是简单很多 04/30 02:52
27F：→ Ice9: 现在做 mutation 不需要用到 two-step 了啊。而 primers 互 04/30 13:32
28F：→ Ice9: 补是常用方法。另外，你的 mutation 往各自的 3' 端会不会 04/30 13:34
29F：→ Ice9: 有非常高的G/C比例，也要考虑一下它们的作用。然後，跑胶时 04/30 13:35
30F：→ Ice9: 最好加个对照组：原plasmid和切过一刀的等等。 04/30 13:36
31F：→ blence: 最早期SD的stratagene protocol就建议用完全互补阿 04/30 21:13
32F：→ blence: x兄可以看一下Quikchange manual 04/30 21:17
33F：→ blence: SD就是要省掉ligation步骤,还加ligase就可惜这设计了 04/30 21:20
34F：→ xxtomnyxx: 喔喔原来如此！但这样我有个疑问，在PCR结束後加一个缓 04/30 21:47
35F：→ xxtomnyxx: 慢降温的 hybridization 步骤会不会比较好？ 04/30 21:47
36F：→ xxtomnyxx: 补充，94 C 3 分钟後再缓慢降温。 04/30 21:48
37F：→ soom: 也许每个case不同，但个人经验中Quickchange跟inv-PCR 04/30 23:15
38F：→ soom: Quickchange做了快一个月没出来, PCR+PNK+Ligase一次就成功 04/30 23:16
39F：→ soom: 不过这是个人经验，仅供参考 04/30 23:18