各位版大好，小的目前在做的是要将vibrio属的细菌做gene knockout 由於是knockout新手 还请各位帮忙看看是不是有哪部分的思考出错了QAQ 使用的donor strain是E. coli S17-1 自杀载体的部分是用pk18mobsacB 目前做到的部分是 透过PCR将目标基因的上下游各1000bp 接到pk18上後 转型至S17-1内 之後将S17-1和vibrio隔夜培养的菌液1:1混合 涂抹在TCBS+kan(30 ug/ml)培养基上培养O/N 成功生长的是所谓的单交换成功吧? 因此我挑选单一黄色菌落 划线分离於TCBS+10% sucrose 培养基上 依我之前看的paper理解 长出来的菌应该会是同源重组双交换成功的菌(kan敏感以及sucrose抗性) 但随後我将colony划线分离於LA+kan 以及 LA+10% sucrose 结果两者都有菌落生长 然後我将LA+10% sucrose上的菌去做目标基因的PCR 发现基因还在 代表我knockout 失败 这边我疑惑的点是 如果没有交换成功 菌体内plasmid上的sacB不是应该还存在吗? 那又为何会在sucrose plate上生长呢? 然後我将LA+kan上的菌用LB+10% sucrose培养 过了三天了 还是很清澈 这样是表明其实sacB是有作用的@@? (当初我有将S17-1含pk18 拿去划线在LA+10% sucrose plate 结果长得好好的 因此我才怀疑我的sacB是不是没有作用?) 假设sacB有作用的话....那有什麽办法可以增加他交换的机率吗? 又或者 一开始单交换那里根本没有成功? 菌株会有kan抗性是因为plasmid在里面但是并没有嵌上chromosome? 以上 打得有点混乱 不好意思 ps.建构好的pk18 我一直没办法PCR出我插入的2000bp片段 可是分别1000去PCR(分别使用上游跟下游的primer) 却都有产物 让我有点困惑(使用的温度条件都一样 55度 10 cycle -> 58度 20 cycle) 各位有什麽建议欢迎提供> < --

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