各位大大好~ 最近钻研很多ChIP protocol也实际做过四次以上，IP下来的DNA最後都去跑PCR,但是只有 一次PCR的结果有P出来而同次的IgG同样也有p出来，另外每次实验的input皆有P出，但是 IP和IgG(跟别人借kit用的)就只有一次有东西，这是跟着别人paper做的希望能做出一样 的结果，但之後克服了IgG没有nonspecific binding之後，我的IP也没有东西了，想跟各 位高手讨论讨论~(我们家没有买kit,有前人留下不怎麽清楚的protocol) 经过比对成功与不成功的实验步骤的差异想请问以下过程是否真会影响到IP(抗体用1.5ug ,使用磁珠IP) 1.salmon sperm加的时间点 成功:在preclear(30min)时(已dilute10x)已加入salmon sperm DNA(final为20ug/ml) 及PI 未成功:preclear同时加了PI和leupeptin,preclear完後才加入salmon去IP note:成功的那次因为有nonspecific binding的问题,之後的实验改变salmon加的时机， 也有增加prclear用的beads,解决非专一性结合，IP却没有东西，salmon sperm DNA会不 会影响样品与抗体的结合 2.IP buffer 成功:20mM Tris pH8,300mM NaCl,0.01%sds,1.1%triton 1mM EDTA 未成功:有用过成功的buffer，也有降成150mM NaCl去试 3.elute+de-crosslink条件 成功:67度2hr+100度10min 未成功:65度1.5hr+100度5min note:有protocol使用磁珠的条件是未成功的那个，因为想缩短实验时间因此之後都用第 二个，第二个有方法有先确认过可以decrosslink,但不确定是否有elute下来 外加sample都是用同一批，保存也没超过一个月，我都不知道该不该相信有P出来的那次 结果~实验条件是一次动一两个，有参考别人的protocol且为了让步骤更好才决定 动条件，有不够详细的地方再麻烦各位提出谢谢 补充:会认为IP有成功是因为我同时p好几组primer,就只有paper上的target有被p出来， 其他则没有，IgG也只有主要要看的target有被p出来，照理来说有nonspecific binding 的话其他组的IgG也应该会p到东西吧～但我先把它归类在有nonspecific binding 的问题 --

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