作者wishforever (wishforever)
看板Biotech
标题[求救] gibson assembly
时间Wed May 4 17:30:16 2016
我想要问一下 gibson assembly 过程中有没有什麽特别需要注意的
我的vector大概7kb insert大概2.5kb
因为接了快十次都没成功
primer由网路上NEbuilder设计 cover的位置有再三确认过
当中也换了几次primer都没成功
inser跟vector是由PCR clean up纯化 纯化後回溶在水
纯化後有在跑胶check
反应时间为50℃反应2小时 直接transform到DH10b
vector浓度大概100ng/ul 取1.5 insert也大概100ng取 4.5
Gibson assembly取6 不补水直接反应
长出来的菌数大概50颗左右 但都没有预期片段
因为有同时利用其他方式在clone 其他基因 那边就很顺利
不知道gibson assembly有什麽地方需要特别注意的吗?
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1F：→ xxtomnyxx: 改成 GelExtraction 纯化试试，也许是 primer dimer 惹 05/04 17:59
2F：→ xxtomnyxx: 的祸。 05/04 17:59
3F：→ Ianthegood: molar ratio比1:9 有没有试过少一点的倍数啊 05/06 00:55
4F：→ Ianthegood: 接口序列没有二级结构吧 05/06 00:58
5F：→ Ianthegood: primer有磷酸化? 05/06 01:22