作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
标题[求救] HMW protein detection
时间Sun May 8 23:11:57 2016
版大们晚安
小弟最近在处理一个~250kDa的protein
但western一直都压不太出来....(以下会详述)
有逛了一些讨论版 但还是做不太出来/很丑
因此想上来请问一下大家的看法
1. 由於我的protein是lipo外送的
理论上量会很多 (以前paper也很多人做过)
我是想问 如果我今天送一样量 (ex:10ug的DNA)
一个是表现10kDa的蛋白 一个表现250kDa
两个表现量会有差别吗? (还是一定要考虑protein的modification)
2.Cell lysis
目前是用0.2% NP40 lysis bfr做 学长之前做出来的条件
rocker 转+ vortex 15min (会太短吗? )
也因为此protein会secrete, condition medium会外加至0.2% NP40 & 1mM PMSF
去掉cell debris後放冰上
之後Lysate 跟medium 做IP o/n, wash三次後加2x smp bfr 煮
(有试过不IP直接跑 看不到一点痕迹
别的实验室做此protein, 即便是外送 都还是会IP 所以照做)
3.SDS-PAGE
我之前是跑4%的gel 但我上胶是5%....
这会影响吗? (跑出来是歪歪扭扭的没错 但想确认； pH上6.8下8.8)
跑胶条件: 90V 约2hr ( Biorad tetra cell system)
Running bfr 是tris-Glycine SDS (就一般用的)
Marker是Thermo 的Spectra MR (Max 300kDa)
PS 此情况下 marker位置准吗?
4.Transfer
条件是根据讨论版的结论测的 125mA 120mins
Transfer bfr: Tris-Glycine / 10% MeOH / 0.05% Tw20
(建议SDS或tw20或不加的都有,我就用较weak的)
transfer完後 marker都有过去
後续处理就是一般的western方法 之前做到130kDa的protein都没问题
(抗体的部分 因为我学长压的出来 所以应该不是这问题
但跟一般100kDa以下的压出来算是不太好看 )
就这个250的一直压不出来...
希望大家能给一些意见~~
谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 36.228.136.116
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1462720320.A.33E.html
1F：→ blence: 如果,一个protein没有特殊理由都得先IP才能用WB侦测,那表 05/08 23:19
2F：→ blence: 示抗体有根本的问题:请先了解抗原-抗体特色,与IP的目的 05/08 23:22
因为不只我们实验室啦@@...10几年前的paper~最近 用Hela/COS-7做外送 还是会先用IP enrich (或是TCA 沉淀)
而且抗体跟我们家现在用的不同只
我也想过这东西真的有少到一定要IP吗 所以才有 1. 的问题
但我要认真想一下我家抗体是不是坏掉...囧
3F：→ blence: 我做3,400kd才用6-7.5%PAGE,250kd而已的大小不太是问题 05/08 23:26
目前也正改用6% gel
想请问一下B大的跑胶及transfer条件是?
4F：→ blence: 你内容说学长做的出来,那应该先问他?(还是又毕业离开了?) 05/08 23:39
还在XD 但他习惯跑大片胶 我不太会处理大片的 所以跑小的
因此跑胶condition有些差异
剩下基本上是完全发楼
5F：推 joseph103331: 1当然会有差, plasmid的量决定在硷基多寡, 两者 05/09 01:15
6F：→ joseph103331: 大小差这麽多, plasmid个数根本不能相比 05/09 01:15
7F：→ joseph103331: 有点口误, DNA的量决定在硷基多寡, plasmid的量就需 05/09 01:17
8F：→ joseph103331: 要考虑到质体的大小, 同样10ug, 10kDa的绝对比 05/09 01:17
9F：→ joseph103331: 250kDa的表现质体多非常多个,表现量就会少很多倍了 05/09 01:18
J大说的就是我一开始想的点...
10F：→ blence: 用plasmid多寡来解释表现量看似合理,但如果不是以定量RNA05/09 12:13
11F：→ blence: 而是WB,不同的抗体是无法证明表现量差异05/09 12:14
12F：→ blence: 而且实际算一下plasmid,100bp跟5.5bp,看似差55倍,但如果接05/09 12:18
13F：→ blence: 到pcDNA3上,一个copy变成5.6k与11k的差异,只差两倍而已05/09 12:19
14F：→ blence: 或许不同长度的转录效率,比plasmid的copy差异还大很多05/09 12:21
谢谢b大 你顺便帮我解决了一个快两年的问题....
那假若我今天在两个protein後都接Flag 并用flag 做western 应该可以解决抗体的问题?
15F：→ Ice9: WB不容易测到，除了抗体问题，还有可能从一开始就有问题啊。05/09 15:44
16F：→ Ice9: Plasmid Seq 坏了，Transfection 效率差(你的对照组如何？)05/09 15:46
17F：→ Ice9: 跑胶时的量——大片胶不难搞，你应该学着如何建。05/09 15:47
18F：→ Ice9: 既然以前很多人做过，那蛋白修饰问题应该不是影响你结果的主05/09 15:49
19F：→ Ice9: 要因素。另外，目标细胞的状态也有可能会影响结果。05/09 15:50
20F：→ tynse71864: 先谢谢各位 这几天想了一下後再来板上回应05/11 12:48
plasmid跟seq都是对的喔 Hela transfect大概6~7成,细胞状态应该OK
其实大胶我会 就只是单纯觉得如果小胶可以 为何不能跑小的就好 (因为就看一条band)
※ 编辑: tynse71864 (36.225.70.25), 05/13/2016 12:23:00
21F：→ blence: 想这样比较表现量还是从RNA着手;同一construct把tag接N或C05/13 19:17
22F：→ blence: 抗体侦测都可能不同了,何况不同蛋白变因更大05/13 19:21
23F：→ blence: 如果是同construct的delete或mutation,应该就方便这样比较05/13 19:25
因为我的 wt跟 mutant protein， 每次外送 结果表现量都不一样多 (但 wt一定比较多,只是看多几倍)； 但试过接 flag後外送, IB Flag 表现量就会一样。 抗体是bacteria recombinant wt protein打兔子来的
※ 编辑: tynse71864 (42.73.20.24), 05/13/2016 20:29:34
24F：→ tynse71864: 我会在 check 看看,非常感谢 05/13 20:31
※ 编辑: tynse71864 (1.171.39.66), 05/15/2016 11:18:41
25F：→ Ice9: 大片跑下来，大MW可以比较漂亮的。你确定只会有一条band? 05/15 22:39
26F：→ Ice9: wt和mt表现量差到两倍以上，不是就足以让你们探讨其中的问题 05/15 22:43
27F：→ Ice9: 了吗？会不会是稳定性变低了，或对细胞很不友善？XDD 05/15 22:46
28F：→ blence: 好像越看不懂了,前面讲HMW压不到,後面又可以看到wt,mt差异 05/15 23:16
29F：→ blence: 会不会你只是mt表现的问题,就无关跑胶至WB的过程了阿 05/15 23:18