作者kuyar (Alice)
看板Biotech
标题[求救] WB 背景超黑
时间Tue May 17 21:57:47 2016
原po是WB 新手，最近压一个蛋白，在相同条件下:
40 ug 蛋白量跑胶 ; transfer 320mA 2hr ;用5%脱脂牛奶 blocking 1hr ; 用TBST 洗5m
in 一次後加一抗; 一抗1000倍(用5%BSA稀释)4度overnight ;用TBST洗3次5min ; 加二抗
10000倍); 用TBST洗3次5min後压片。
但有时後背景乾净，有时後背景超黑(整片黑那种),请问会是什麽问题呢? 目前只有sampl
e不一样，其他条件大致一样 , 会是跑胶或是transfer的问题吗? 我压其他的蛋白ex: ac
tin 背景都很乾净，卡了好久，希望大家帮帮我 QQ
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 36.230.162.35
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1463493470.A.980.html
1F：→ osla30: 上完抗体後，wash时间跟次数？
都是5min,3次 05/17 22:36
2F：→ roc0860: blocking的时间呢？
都是一个小时 05/17 22:55
3F：→ moon0126: 配一抗有没有加牛奶或BSA?
一抗是用5%BSA 05/17 23:01
※ 编辑: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:10:10
4F：→ blence: 发文说明明明有写"请将实验的步骤、所用的条件大致列出"阿
补充了!!05/17 23:13
※ 编辑: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:23:37
※ 编辑: kuyar (36.230.162.35), 05/17/2016 23:24:12
5F：推 bluecsky: 有没有多load一个必定成功的来做对照组? 05/18 06:10
6F：→ bluecsky: 因为如果blocking没问题 antibody也是一样的 那有时黑 05/18 06:11
7F：→ bluecsky: 有时乾净有没有可能是因为你的sample的讯号强度不够 05/18 06:11
8F：→ bluecsky: 造成相对的脏?不过你压片时间都一样这样也怪怪的 05/18 06:13
9F：→ bluecsky: 如果可以 把成功的图跟失败的图贴上来或许更容易有解答 05/18 06:14
10F：→ a09356684: 二抗我是用20000X稀释 加在TBST含5%牛奶中一小时 05/18 08:17
11F：→ a09356684: TBST wash都10min 二抗浓度太高而sample讯号又弱的话 05/18 08:18
12F：→ a09356684: 二抗很容易乱接 但讯号强的在二抗时我就不会再加牛奶了 05/18 08:21
13F：推 ebv: 试试:1.洗更多次点或延长时间 2.降低二抗至2万倍甚至更低 05/18 17:34
14F：→ ebv: 另外1抗有时也会有影响 poly会比mono脏 但你是背景全出来了 05/18 17:35
15F：→ ebv: 也有可能抗体会乱黏(杂质或浓度高)参考data sheet的建议看看 05/18 17:41
16F：→ e8795623: 40 ug好像有点太高了耶 我都用2ug/well就很够了 05/18 18:15
17F：→ satan317: 楼上要看抗体强度 05/18 21:45
18F：推 aaaazzzz: total protein 20-50ug应该都可接受 05/18 22:06
19F：→ aaaazzzz: 二抗有时我用1:4000,背景也还好(不过要看牌子,有些真的 05/18 22:09
20F：→ aaaazzzz: 很脏),我认同sample表现量低(所以拉高曝光时间造成背景 05/18 22:10
21F：→ aaaazzzz: 脏),或者wash不够(转速不够或时间不够久) 05/18 22:10
22F：推 tynse71864: 你一抗用多少体积阿? 是用杂合袋吗? 05/18 22:34
23F：→ keystones: 据个人经验,可能一抗浓度太高,可以考虑再多稀释一点 05/20 10:33
24F：→ keystones: blocking milk可以过滤,避免杂质卡在membrane 05/20 10:35
25F：→ keystones: 另外抗体是poly clone或mono clone,压出来品质会差很多 05/20 10:36
26F：推 joseph103331: 我的经验上,背景黑色带点状的一般是一抗过高 05/22 12:28
27F：→ joseph103331: 黑色云雾状的是二抗过高, 多loading会造成整条很强 05/22 12:28
28F：→ joseph103331: 但不至於背景太脏 05/22 12:28
29F：→ joseph103331: Wash可以拉长,抗体可以在4度作用都能减少背景值 05/22 12:29
30F：→ joseph103331: 但目前的状况很像是二抗每次配不一样造成的,尽量用 05/22 12:30
31F：→ joseph103331: pipet的方式精准配出二抗才有助於抓浓度 05/22 12:30
32F：→ a910298: 同一种二抗,看要不要一起在同一杯beaker 2%牛奶配,再利 05/31 10:10
33F：→ a910298: 用搅拌子搅拌,二抗会分布较均匀,而不会只集中在一个地方. 05/31 10:10
34F：推 ararthur: 因为没有看到图 几个简单的建议你可以试试 全程用5%BSA 06/15 02:26
35F：→ ararthur: 或Milk 我试过BSA可以 Milk出大问题的 第二个换一家二抗 06/15 02:27
36F：→ ararthur: 或用原本二抗+同sample memb剪几条 2倍2倍titrate看看 06/15 02:28
37F：→ ararthur: 3 换包底片...在想该不会是底片不小心被曝光过了吧 06/15 02:29