作者niwe (云烟)
看板Biotech
标题[求救] 请教制作stable clone cell line花的时间
时间Sun May 29 22:21:02 2016
各位好，
小弟想请问制作stable cell line的时间，
先前有做transient transfection，(要transfect的质体为pCMV载体)
使用polyjet这种kit(另外也比较过lipofectamine 2000及3000)，
效果都不是很好，
因此想把这载体上的目标蛋白先切，再接到病毒的载体，
再进行site-direct mutagenesis，
然後把这两种质体藉由病毒感染的方式使细胞能持续表达，
请问这样的时间大约会花多久？
(我先前没有做过，但实验室有位助理有经验，
他初步估计要2-3个月以上的时间)
备注：上次听到一位同学，
他把这实验外包给国外的实验室，
花了十七万元(但不保证成功)
不晓得这样换算成实验的时间有没有比较划算？
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 210.60.122.151
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1464531665.A.D38.html
1F：→ sunorange: 17万偏贵 ，如果自己做 ，大约也要三个月 05/29 23:31
2F：→ e8795623: 顺利三个月~17万不保证成功也太..... 05/29 23:35
3F：→ blence: 讯息不足,是从cloning到挑出mix clone,还是病毒感染或到 05/29 23:47
4F：→ blence: single clone,而且细胞来源等等,答案差异很大阿 05/29 23:49
pCMV上的载体已经有我要的target protein，
要transfect到口腔癌细胞上，
先前发现使用的口腔癌细胞使用polyjet transfect EGFP约3成，
→ Ice9: 为什麽不先做突变再转到病毒载体上？
谢谢喔，但我不晓得先mutation再转到病毒载体，
和转到病毒载体再做突变的差异？
05/30 01:30
5F：推 joseph103331: 细胞种类 挑选方式 是否有类似GFP的marker都会影响 05/30 19:03
6F：→ joseph103331: 速度啦....把材料都摊开来才比较好抓时间 05/30 19:04
GFP marker的意思是甚麽呢？
我先前曾经把我要的protein接上EGFP-N1，
tranfection之後，再使用G418来筛选，
结果养了二代细胞就不亮了，
不晓得是否带有EGFP的fusion protein就比较难养？
※ 编辑: niwe (210.60.122.151), 05/30/2016 22:23:34
7F：→ blence: 看到你的几个回覆觉得有着比stable clone更复杂的问题 05/30 22:55
8F：→ blence: 不介意多少钱的话,全部外包是最好的办法了 05/30 22:58
9F：→ niwe: 听到b大这样说，听起来非常不乐观，第一次操作就学个经验吧 05/31 23:00
10F：推 silverberry: 不知道你想要的是 stable pool 或是 stable single 06/07 11:39
11F：→ silverberry: clone, 这两个时间会差非常多。 06/07 11:39
12F：→ silverberry: 要做病毒的话，实验室生物安全柜是不是能配合上。 06/07 11:41
13F：→ silverberry: 想用 adeno/retro/lenti 哪个系统呢? 06/07 11:42
14F：→ b1l3hlkff: 如果细胞都好的话两周到三周，HEK293ft产生病毒三天， 08/14 17:18
15F：→ b1l3hlkff: 同时感染细胞，看你细胞能长多快，三代後就能拿到。我 08/14 17:18
16F：→ b1l3hlkff: 自己是做乳癌的Hs578t大概两周就拿到了，但长得慢的可 08/14 17:18
17F：→ b1l3hlkff: 能要一个月。不过建议你把筛选的抗生素换成puromycin， 08/14 17:18
18F：→ b1l3hlkff: G418很难筛。 08/14 17:18