原文恕删 m(_ _)m 第一次发长文，排版不良请见谅。 刚好过去有建立 stable clone cell line 的经验， 在这里跟大家分享。 ---------我是分隔线--------- 目前常用的病毒转染系统有 retro, lenti, adeno, adeno-associated virus 各有优劣和适用范围，可以搭配实验室的需求挑选 (1)。 厂商 Clontehc 有详细的比较 (2) http://goo.gl/cVecku 简单来说，可就三大部分考虑 host 虽然这些病毒系统的感染效率都不错，但是总是会遇到一两个难搞的 host cell line。 另一个关键是 host cell 会不会分裂，这与病毒感染机制有关。 genome integration 载体/外源基因嵌入 host genome，虽然相对於以 episome 形式来说， 更能确认不会在细胞复制过程中消失。 但是嵌入 host genome 的位置可能会影响 host 本身的特性； 或是受到 host genomic DNA epigenetic modification 的影响改变外源基因的表现。 transgene property 几个？多大？表现量要多高？ 不同的病毒载体有不同的特性，载体设计也可以增加自由度。 配合实验室需求，挑选最适的系统可以减少额外的变因。 在这里 (因为个人偏见) 以 lentivirus system 为主 (3)。 流程大概可以简化为 virus packaging → infection host cells → selection virus packaging 合适的 HEK293T cell 作为 virus packaging 的 host。 不加准备 packaging vector 的准备时间， 被转染的 HEK 293T cell 可以在 48-72 h 把 lentivirus 做出来。 新鲜的 lentivirus 可以直接感染 host cell，或是分装冷冻在 -80 备用 (4)。 infection host cells 把 lentivirus 病毒液加到 host cell 培养基中。 理论上 24 h 就可以观察到外源基因的表现。 有时病毒对 host 太毒，host 会病恹恹的。 感染条件稍微微调一下，host 在去除病毒液之後，都会慢慢好转。 selection 常见的 drug selection 的 killing curve 漂亮的话，drug 筛选效果都不会太差。 用 GFP/RFP 等等的 reporter，用 FACS 筛选也很方便。 一切都是配合实验室的设备和後续实验的需求。 时程和工作量上，stable pool 和 stable clone 会差很多。 主要是 single cloning 的效率和工作量。 参考厂商的网页 http://goo.gl/ykbfzm 虽然这张图是 CRISPR 的流程，感染两次 lentivirus。 不过一个 stable pool 和 clone 大概就是 2 周和 6 周的差别。 (当然是指一切就绪顺利的情况下~) 到这里为止，差不多就有想要的 cell line 可以继续做研究了 (5)。 备注 (1) 因为 iPS 很红的 sendai virus 没被列入讨论。 (2) 有不少厂商都有卖这些系统。学校里花小钱建立系统的方法也有很多~ (3) 未来 CAR-T 都可以打进人体了，lenti 系统 (对操作者) 的安全性应该 ok~ (4) 新鲜的病毒液配合需求尽快进行浓缩、纯化、定量，4 度暂存的时间越短越好。 (5) 如果担心细胞株稳定性，可能还要做一些稳定性测试等等，或是监定嵌入位点。 ---------我是分隔线--------- 感谢收看 m(_ _)m 当初进入这个领域时，受到版友大大们的照顾。 以这篇 "心得文" 再次感谢领进门的版友师傅们。 也希望可以大家可以一起分享心得~ --

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